生物之基础过关36(基因工程和细胞工程).doc

咼二生物一轮基础过关（36） 2016/12/20编制人：祝群-、基因工程1. 原理：定向基因重组，优点：克服远缘杂交不亲和的障碍2. 基因工程的基本程序：目的基因的获取-基因表达载体的构建T将目的基因导入受体细胞 -＞目的基因的检测与鉴定第一步：目的基因的获取1. 工具：限制酶作用特点：能识别特定的碱基（脱氧核昔酸）的序列，并在特定的位点切 割；作用的结果：形成黏性末端或平末端；此种酶除了用来提取目的基因，还用来切割运载体; 提取目的基因时该酶作用于DNA中的磷酸二酯键2. 获取方法：从基因文库中获取；PCR技术；人工合成法（反转录法、化学合成法）（1） 基因文库中包含了某种生物的全部基因，而cDNA文库是由mRNA反转录产生的，因此 无基因中的启动子和基因中的内含子，包含某种生物的部分基因2） PCR技术：DNA解旋（90-95C）＞引物结合（55-65C）＞互补链合成（70-75C）%1 此过程反应体系的主要成分包含：扩增缓冲液、水、4种脱氧核昔酸；两种引物、耐高温的• • • •DNA聚合酶、模板DNA等1 一个DNA经过4轮循环后同时含有两种引物的DNA片段所占的比例是7/8%1 设计引物的依据是目的基因两端的部分DNA序列%1 设计引物的注意点是：一是两种引物之间不能碱基互补配对；一种引物自身不能碱基互补配 对而出现自身折叠。

1 此过程中退火（复性）的温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定，一般引物对小G-C 含量高的可采用较高的退火温度第二步：基因表达载体的构建（基因工程的核心步骤）1. 工具：限制性内切酶、DNA连接酶2. 基因表达载体主要包括启动子（化学本质是DNA片段，它是RNA聚合酶识别和结合的部 位，它的作用是启动目的基因的转录）、终止子、目的基因、标记基因（鉴定受体细胞中是否 含有目的基因）、复制原点等记住组成及作用！）3. 常见的运载体包括：质粒、动植物病毒、噬菌体衍生物，运载体具备的条件有：能在受体 细胞中复制并稳定保存；具有一至多个限制酶切点；具有标记基因4. 如果用同一种酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶处理，得到的产物有目的基因・ 运载体，目的基因■目的基因；运载体■运载体，而且目的基因和运载体相连的表达载体可能不 能表达的原因是：反向连接因此，针对上述问题，常釆用双酶切切割目的基因和运载体，目 的就是防止目的基因的任意连接和质粒的自身环化5. 构建基因表达载体的日的是使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传，同时能表达和发挥• •作用第三步：将目的基因导入受体细胞1. 受体细胞是植物细胞时常用的导入方法是：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法。

1）农杆菌转化法：将目的基因与Ti质粒（含有T-DNA）结合构建基因表达载体、将基因 表达载体导入农杆菌，再用含有重组Ti质粒的农杆菌导入植物细胞，利用T・DNA可转移的特 点，将目的基因插入到植物细胞的染色体DNA，再利用植物组织培养技术技术将导入了目 的基因的植物细胞培养成新的植株2. 受体细胞是动物细胞时导入方法是显微注射法常见的动物受体细胞是受精卵或者胚胎T 细胞,原因是这些细胞的全能性高★乳腺生物反应器：将药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，通过显微注射的方法,导入到哺乳动物的受精卵小，然后将受精卵送入母体，使其生长发育成转基因动物3. 受体细胞是微生物细胞时导入方法是用Ca2+处理，使细胞变成感受态1）基因工程常选择微牛物细胞作为受体细胞的原因是：多为单细胞牛物，遗传物质较少,繁殖快2）当受体细胞是大肠杆菌时，由于该生物细胞内没有内质网和高尔基体,因此从中提取出 的蛋白质还要经过人工修饰才具备生物活性，而受体细胞为酵母细胞时则不需要第四步：目的基因的检测与鉴定注意：区别转录、翻译和表达（包括转录和翻译）的关系！（1）初步筛选：通过表达载体上的标记基因检测目的基因是否导入受体细胞（2）分子水平的检测:%1 检测受体细胞中是否含有目的基因的方法是：DNA分子杂交技术（DNA-DNA）%1 检测受体细胞中是否转录出相应的mRNA:分子杂交技术（DNA・RNA）（提醒：以上两种技术利用的检测工具都是单链DNA探针，该单链DNA探针是能和目的基 因互补配对的带有放射性同位素标记的单链DNA片段。

1 检测受体细胞中是否表达出相关的蛋白质：抗原■抗体杂交技术（用相应的抗体和提取出来 的蛋白质杂交）（3）个体水平的检测：需要做抗虫或抗病的接种实验等二、蛋白质工程1、蛋白质工程的实质：根据蛋白质的结构与功能之间的关系，通过改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的、具有优良特性的蛋白质2. 蛋白质工程的基本原理: 预期蛋白质功能一＞ 测定蛋白质三维空间结构一推测应有的氨基酸序列-4戈到对应的脱氧 核昔酸序列（基因）T具有预期功能的蛋白质3. 蛋白质工程的应用：（1） 通过改造酶的结构，有目的地提高蛋白质的热稳定性2） 合成嵌合抗体3） 改变蛋白质的活性基因工程和植物体细胞杂交都能定向改造生物的遗传物质，克服远缘杂交不亲和的障碍基因工程育种与杂交育种相比优点是能克服远缘杂交不亲和的障碍，与诱变育种相比的优点是 能定向改造牛•物的性状三、 植物细胞工程1、 植物组织培养的原理：植物细胞的全能性用到植物组织培养的育种技术有：基因工程育种、单倍体育种、植物体细胞杂交育种 克隆动物的原理：细胞核的全能性动物细胞培养的原理：细胞增殖单克隆抗体的原理：一种浆细胞只能产生--种特定的抗体。

2、 人工种子优点：完全保持优良品种的遗传特性，不受季节的限制：方便储藏和运输动物细胞培养条件：无菌、无毒（添加抗生素）；有营养（糖、氨基酸、促生长因子、无机 盐、微量元素、动物血清或血浆）；温度和pH值；气体环境（Ch是细胞代谢所需、C：02 维持培养液pH）四、 动物细胞工程1、 核移植中选用卵细胞的理由：体积大容易操作：细胞质可以澈发细胞核全能性的表达由于胚胎细胞分化程度低，恢复全能性相对容易，一般选用胚胎细胞核移植传10代以内的细胞能保持正常的二倍体核型2、 单克隆抗体的特点：化学性质单一，特异性强，灵敏度高，易于大量制备3、 杂交瘤细胞的特点：既能大量增殖，又能产生特定抗体制备过程中两次筛选：先用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，再经过克隆化培养和抗体检测筛选出能产牛-特定抗体 的杂交瘤细胞五、 特别提醒：1、 植物细胞工程的两个重要的技术：植物组织培养技术、植物体细胞杂交技术2. 檀物组织培养技术提醒：①条件：离体、营养物质、激素、适宜的温度和PH等：②包括 脱分化形成愈伤组织（分裂旺盛、高度液泡化的薄壁细胞，可作为诱变育种的材料）、再分化 形成植株③在脱分化和再分化过程生长素和细胞分裂素的比例不同，脱分化过程需要避光培 养、再分化过程需要光照。

④植物组织培养技术不一定得到完整植株，可以得到细胞产物；⑤ 可以结合微牛•物的实验室培养过程的灭菌操作考查3. 植物体细胞杂交提醒：①包括植物细胞融合和植物组织培养；②区别植物细胞融合和动物 细胞融合的方法的不同；③植物体细胞杂交的结果实得到植株，而动物细胞融合得到是细胞产 物；④植物细胞融合后得到的植株的染色体数目是两个细胞之和4. 区分抗病毒植株和无毒植株（不带病毒）的培育方法：抗病毒植株：基因工程，导入相应抗病毒基因脱毒植株：植物组织培养，利用植物分生区附近（如茎尖）的植物病毒极少，甚至无病毒，利用茎尖进行组织培养，再生的植株可能不带病毒，从而获得脱毒苗5. 动物细胞工程（动物细胞培养、动物细胞融合、动物细胞核移植、生产单克隆抗体）6. 动物细胞培养：（1）植物组织培养用的是囲体培养基，加入的是细胞分裂素、生长素和 蔗糖（作用：提供能源、调节渗透压）等；动物细胞培养用的是液体合成培养基，加入的是葡 萄糖、血浆、血清等，还需要氧气、二氧化碳（维持培养液PH的稳定）等气体条件7. 单克隆抗体的制备至少需要两次细胞筛选：第一次筛选出杂交瘤细胞（用选择培养基）: 第二次用相应的抗原检测筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞（抗原一抗体杂交）。

单克隆抗体 的优点是：特异性强、灵敏度高、可大量制备作用是作为诊断试剂、治疗疾病、运载药物8. 动物细胞核移植的受体细胞是减数第二次分裂中期的去核的卵母细胞请妥善保管好自己的资料!。