三种土壤矿物对硝酸盐还原菌活性的影响.docx

三种土壤矿物对硝酸盐还原菌活性的影响摘要1 前言1.1 土壤反硝化作用 一直以来，人们针对土壤矿物对硝酸盐还原菌活性的影响积极进行研究，其中， 人们在研究土壤氮素循环的时候遇到各种困难，因此，人们把其当做一个具有挑 战性的课题来研究，针对这个研究，主要研究其很多方面，即如何保存土壤氮素、 如何治理氮污染、如何排放温室气体、如何平衡全球氮素等目前我们对氮素循 环的理解还远远达不到这一目标例如，在农业方面生产充足的食物需要较高的 氮素投入，而较高的氮素投入又会给环境造成压力在进行氮素转化的时候，往 往需要大量微生物土壤在进行反硝化的进程中，有一个非常重要环节，即基于微生物的载体作用， 促进地球氮素进行生物与化学循环，在这个过程中，受到全球气候改变的影响 基于反硝化微生物，发生还原反应，使硝酸盐最终形成亚硝酸盐、一氧化二氮以 及氮气等物质因此，存在于土壤中的反硝化微生物发挥重要的作用，即对土壤 温室气体的排放，以及氮素的丢失进行调控，所以，有必要对这一类微生物进行 研究这种物质也被用于农业方面，比如，基于土壤的反硝化作用的把控，保留 大量氮肥，同时也用于环境方面，即除去土壤中大部分硝酸盐土壤中参与反硝化过程的微生物极其复杂它涉及原核生物共13个科中的10个科。

这些发生反硝化作用的微生物基本都属于非自养型的物质，其生活需要对现成的 有机物进行氧化反应对于反硝化细菌来源很广，这样一来，随着土壤有机质含 量得增高，其反硝化潜势就随之而增高，比较与土壤实际的反硝化能力，其反硝 化潜势比较高，其中含有一些限制因子，即针对硝态氮的供给速度、扩散速度， 以及土壤通气等地下水中有机质含量很低，反硝化细菌数量也少，反硝化过程 非常微弱，所以硝态氮一旦经过土壤淋入地下水就不容易自然清除，这是氮素与 环境研究中需要加倍重视的问题土壤中可培养的反硝化细菌数量大约仅占所有能够还原硝态氮细菌总数的1/3 说明反硝化细菌并不是还原硝酸的主导区系，国内外不少相关报道按照土壤微生 物学原理，微生物中往往有一些能够还原硝态氮，且其数量最多的那种类群能够 决定土壤中硝态氮的还原行为从实际来看，土壤主要发生反硝化反应，为什么 主导区系与主导过程不吻合我们疑有硝酸还原菌的贡献目前，在土壤中能够发现多种多样的硝酸还原菌，这些菌非反硝化菌，但其之间 能够发生反应这种菌经过还原之后所得产物被当作其他菌的底物继续反应，最 终把硝酸根变为氮气这种形式，与反硝化菌的作用类似1.2与反硝化菌有关的分子微生物生态学研究进展 一些细菌能够发挥反硝化的作用，这些细菌往往在土壤中找到。

人们之所以研究土壤 的反硝化微生物，是为了把握这些反硝化微生物的活性受到哪些因素的影响，进而更加 合理地对其进行调控目前，时代快速发展的同时，加快了分子生物学及其技术的发展, 大部分科学家 积极对反硝化微生物进行研究，包括：针对经过分离、培养形成的反硝化微生物 进行研究,；对没有经过分离、培养形成的微生物进行研究等，但研究成果不是 很理想有待进一步完善20多年以来，分子微生物的生态学技术一直快速发展此种技术采用多种方 法对土壤中微生物等种群结构、活性进行检测，避免了传统方法等缺陷，这些 方法包括：分子探针、PCR扩增、RRNA序列同源性分析、梯度凝胶电泳等与硝 化细菌相比反硝化菌生态学方面的研究难度要大得多，这与反硝化菌的复杂性 有关，同样是反硝化菌，其进化谱系可以相差很远，反硝化的每一步有酶参 与，包括两种或两种以上这不仅需要设计出针对不同酶的多种引物，更有可 能产生过多的需要测序的克隆而使工作极为耗时1.3 影响土壤反硝化作用的因素在进行反硝化作用的时候，氮氧化物发挥末端电子受体的作用, 基于反硝化 微生物，对硝酸盐进行还原，最终形成N20与N2基于反硝化的作用，环境 中的硝酸盐越来越少，保护臭氧层。

所以，人们目前积极研究反硝化作用的机制 及其他微生物的情况很早以前，大部分科学家仅仅针对反硝化作用的影响因素 进行研究, 很少有人对土壤矿物颗粒对反硝化作用的影响进行研究对于土壤矿 物能够与微生物积极发生作用，这是一个重要的生态过程，即在地球表层系统之 中基于这两者的相互作用，微生物或生物分子能够与矿物间发生吸附作用对 于吸附属于一个物理化学过程，其由多种作用力或作用因素一起决定、影响的 主要包括：分子间力、静电力、疏水作用力、氢键、空间位阻效应等因此, 矿 物-微生物吸附过程往往受到多方面的影响，诸如，微生物与矿物的表面性质， 即表面电荷、疏水性、它们所处的环境条件等矿物表面可以把微生物细胞或酶 吸附到其上, 使细胞的代谢或酶的活性发生改变，同时土壤中大部分相关的生态 环境过程受到影响2 材料与方法2.1 土壤样品采集与处理采集湖北省武汉市华中农业大学狮子山上森林新鲜土样，装入塑料密封袋中 后放置于冰桶中带回实验室把土样中的枯枝、烂叶等物质去掉，保存在温度为 4 摄氏度的冰箱内，用于反硝化细菌的分离2.2 菌株的富集培养针对本实验而言，其中，使用的是液体培养基，基于此，富集培养土壤中的 反硝化细菌，这在之后，使用固体培养基进行分离纯化，即以平板划线法为方法。

液体 培养 基组 分为 ： 琥珀 酸钠 8.45g ， NaNO3 0.61g， NH4Cl 0.63g， K2HPO4・3H2O 1.76g, MgSO4・7H2O 0.20g, CaCl2 0.20g, FeSO4・7H2O 0.005g，痕 量元素0.1ml，蒸馏水1000mL调节pH至7.5，后在121°C下灭菌30min,待 用对于固体培养基的配置，主要为：首先准备1 OOOmL的液体培养基，然后把 15g琼脂加入到其中同样调节pH至7.5，并在在⑵C下灭菌3Omin,以备使 用在经过灭菌处理的操作台内，在三角瓶中放入土壤样品1Og，同时把经过灭 菌处理的水加入其中卩90mL，然后对其进行摇晃，时间为一小时，这样做的 目的是为了土样与水混合均匀，使其菌悬液中的细胞均匀分散在这之后，再取 一个新的三角瓶，把适宜的液体培养基加入其中，这种液体培养基需要40mL， 且已在121°C经过灭菌处理的，时间为30 min,同时对其进行冷处理的，其接入 菌悬液的时候，以20%的比例来进行当菌液接种好之后进行培养，需要放在温 度为28°C,速度为180r/min的摇床上进行摇晃按照周期来计算，即七天为一周， 任何一周期，将菌液以20%的比例转入到新的液体培养基中。

总共培养8个周期 即56d,并同时做五个平行样本一直进行到第六个周期时，对此菌液进行稀释， 卩4到6倍，在这之后进行涂布平板培养，卩在琼脂固体培养基上，同时把其放在 温度为28°C的恒温烘箱中，对其进行7-14d的培养，经过培养之后，菌落形态清 晰可见，最终获得单一的菌落我们继续把单一菌落分离出来，然后把其挑入到 经过灭菌处理的液体培养基中，对其进行一个周期的培养，然后使用单一菌落的 菌液进行分离纯化，以平板划线的方法，这样进行多次，最终得到单株的菌株2.3菌株生理生化特性研究吸取2 mL菌株FS1保存液，加入至100 mLLB培养基中，30°C、200 r/min下 培养18 h直到培养完成之后，收取菌液并进行离心操作，另外，菌株需要清洗 2次，即用灭菌的水，在这之后，加入无菌水重悬菌株FS1，即10 mL，此溶液作 为菌株FS1的种子溶液，用于生理生化试验和其他实验将菌株种子溶液接种至已灭菌的各生理生化培养基中，根据文献（东秀珠 2001）观察并记录菌株的生理生化特征以下简述八项重要的生理生化试验的具 体过程2.3.1菌株形态观察选取第八个周期的菌液为对象，对其进行稀释、涂板、划线等操作，在这之 后，我们能够看到菌落的颜色、形态、特征等，即在固体培养基上，并把其拍下 来。

2.3.2革兰氏染色特性（1） 涂片：选取一个干净的载玻片，把一滴蒸馏水滴于其上，放在灭菌处理的 操作台中，菌体借助接种环的作用沾到蒸馏水中，确保二者混合均匀2） 固定；对于载玻片中均匀的菌液，使其朝上放置，然后快速通过酒精灯的 火焰2到3次，一直到有白色菌膜凝固为止3） 初染：用草酸结晶紫染液滴在菌膜上，使其把整个涂面覆盖起来，对其进 行染色，时间为1 min，然后使用蒸馏水对其进行冲洗，这样的操作到流水没有颜 色为止4） 媒染：对于载玻片上剩余的水，往往使用碘液去冲洗，在这之后，在菌膜 上加入足量的碘液，使其被覆盖起来，时间为1min，之后对其进行水洗5） 脱色：冲洗载玻片往往用95%的乙醇，一直冲洗到酒精刚刚不显紫色为止， 在这之后，残留酒精用蒸馏水洗掉6） 复染：用番红染液染色1-2min，水洗，晾干7） 镜检：找样本往往使用低倍镜，在这之后，对其观察用油镜看到的深紫 色，即为革兰氏染色阳性菌株，看到的红色，即为革兰氏染色阴性菌株2.3.3过氧化氢试验首先准备一个干净的载玻片，接着，滴加3%过氧化氢一滴，然后取菌液， 即用铂丝接种环，放入过氧化氢液中，当看到有气泡的话，则为阳性，反之为阴 性。

2.3.4淀粉水解试验对于牛肉膏蛋白胨固体培养基的配置，具体过程如下：蛋白胨log，牛肉膏 5g, NaC15g，可溶性淀粉2g，琼脂15-20g，蒸馏水1000M1该培养基放入菌液 进行培养，时间为7d,直到有显著菌液形成之后，滴加碘液到平板上，同时碘液 要把平板覆盖完全当菌落附近出现不变色的透明圈的时候，则此菌株淀粉水解 显示的是阳性；当看到的是蓝黑色，则其显示的是阴性2.3.5M.R试验（甲基红试验）对于葡萄糖蛋白胨液体培养基的配置,具体过程如下:蛋白胨5g,葡萄糖5g， K2HPO4・3H2O 0.5g，水1000mL将菌株接种于该培养基中37°C培养7d滴加甲 基红试剂在培养基中，数量为一滴，红色说明是阳性，黄色说明是阴性2.3.6V.P试验（乙酰甲基甲醇试验）将菌株接种于葡萄糖蛋白胨液体培养基中，37°C培养7d将等量的菌液和 40%NaO H溶液混匀，加适量肌酸震荡，使溶液充分混匀如果培养基呈红色 则表明该试验结果为阳性2.3.7吲哚试验配置1%胰胨水培养基：蛋白胨10g, NaCl5g，蒸馏水1000mL此培养基中 接种菌株之后，放在温度为37°C的环境下进行恒温培养，时间为7d。

在培养基表 面，加入加入3-5mm高的试剂，加的时候要沿着管壁慢慢操作，当液层界面出现 红色，即为阳性若没有出现颜色，则继续滴加4-5滴乙醚，对其振荡几次之后 静静等待几秒，确保乙醚层浮在页面之上，再慢慢加入10滴吲哚试剂，若吲哚形 成的话，则乙醚层出现玫瑰红色2.3.8明胶液化试验配置明胶液化培养基：蛋白胨5g，明胶100-150g，水1 OOOmL该培养基接 种菌株使用穿刺的方式，放在20°C下进行培养7天，对菌株进行观察，若看到菌 株生长良好，且明胶表面没有凹陷，则为阴性；反之，为阳性2.4菌株的分子鉴定2.4.1菌株FS1总DNA的提取具体操作过程，如下：① 吸取4 mL FS1菌液，1200 r/min下离心1 min，弃去上清，保留菌株② 加入1 mL Tris-phenol溶液，充分混匀后静置5 min③ 200 yL氯仿加入其中同时混合均匀，再静放10分钟然后于4°C、1200 r/min 下离心 10 min④ 把上层水相移到新的EP管中，即2 mL⑤ 加入800 yL异丙醇，静置10 min⑥ 于4°C、1200 r/min下离心10 min，置于50°C烘箱里烘干。

⑦ 加入30 yL预先于65°C下预热的TE溶液以溶解DNA，总DNA保存于-20°C冰 箱里检测的具体操作，如下：① 琼脂糖凝胶的制备：首先称量Agar。