知无不“研”一文读懂免疫共沉淀技术(Co.docx

知无不“研”| 一文读懂免疫共沉淀技术（Co-IP）蛋白间相互作用是细胞各种基本功能的主要完成者，参与几乎 所有的重要生命活动因此，蛋白-蛋白相互作用研究以及建立 相互作用的关系网络图，具有十分重要的意义，也是目前蛋白 质研究领域的热点Co-IP （免疫共沉淀，co -inm un op reci pi tation）是经典的利用抗 体从样品中捕获靶蛋白及其互作蛋白、复合体的一项技术，能 够特异性富集所研究的目的蛋白由于过程中采用了非变性条 件，保留了互作及复合体的细胞内状态相对于酵母双杂交、 pull down等方法，其特色之一便是捕获的蛋白互作发生在所研 究的特定组织细胞内，保存了互作蛋白及复合体的“内源”状Co-IP实验原理：以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相 互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相 互作用的有效方法当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋 白质一蛋白质间的相互作用被保留了下来如果用蛋白质X的 抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下 来Antigen isolation antybadyProtein and inieracling proteinCo-IP实验优势：a） 取材可以选择该目的蛋白所在物种、特定组织、细胞，因此CoIP能够反应该蛋白在天然组织细胞状态下存在的互作关系 蛋白；b） 找出整个复合体中直接/间接互作的多个蛋白，研究复合体 组成；c） 通过与质谱鉴定连用可以初筛到一系列未知蛋白，再通过 其他技术进一步验证。

Co-IP实验注意事项a）需要特异性IP级别诱饵蛋白抗体（重点）；b） 如果没有特异性抗体，则需要考虑构建重组标签质粒，用标 签抗体进行CoIP实验；c） 样品种类实验风险：过表达细胞样品 ＜细胞样品 ＜动物组织样 品 ＜植物样品（通常为转基因植物，标签抗体也很难达到特异性 富集）；d）CoIP-MS风险：由于存在特异性抗体高丰度蛋白，质谱不一 定能够鉴定到诱饵蛋白Co-IP技术案例分析a）两个已知蛋白互作验证（体内实验）常规思路：通过一系列功能实验确定某个信号通路，明确通路 相关蛋白并进行验证文献中：通过CoIP -WB验证诱饵蛋白CEBP B和互作蛋白PGCla是否结合，进一步确定HCP5/miR-3 619- 5p/AMPK/PGCla/CEBPB通路在胃癌中的作用92kDa36kDa36心From: MSC-i nduce dlncRNA HC P5dro ve fatty acid ox ida tion through m iR-3 61 9-5p/AMPK/PGC1a/CEBPB axis to prom ot es temnes s an dch emo-resi stance of gastric can cer.b）通过质谱筛选某个已知蛋白可能结合蛋白（体内实验） 常规思路：通过组学或其他手段确定某个功能相关蛋白，进一 步筛选确定该蛋白作用机理，则可以选择CoIP-MS・文献中：通过CoIP -MS实验筛选到差异蛋白vimentin, CoIP-WB和 GS Tpul 1-dow n等方法进一步确定P62与vimen tin互作。

AiB.pAfPlUIOMWICSfT + 一 + —曲护 —-+*— +HH-vkn. + + , + +GSTGS-T-iM — ±-^^Mla-irtnwnbn 血:刑-4G3T-vUtiviinrwrrQnFrom: p6 2/SQSTM linteracts w ith vimentin toenhance breast canc er metastasis.c）通过质谱筛选某个已知蛋白可能结合蛋白（体内实验） 特点一：使用EGFP融合蛋白标签做IP实验特点二：则是通过两次平行CoIP-MS实验，除了筛选两次差异 蛋白外，进一步将两次差异蛋白取交集缩小筛选范围，从中选 择Ngb蛋白互作蛋白Kth-ECFP 囂 IKl.rp C 22$ cornmort cleni E iit& Un the two hNgb-EGFP -sanrpltt:N5PACTC1 ActinVIM VirnenlJn泊 IC亡 kappa s^iqn^l^ntPG K I PhMph oglycerate 1R PSA 4iQS ri btisc rnSii p^-atedri： SABAN Fi Par rlw-te- aut ◎■內诞銅皿皿补b（亡L酬CKB Creatme kiiuse BJEypeHSPASi 7fi kDa ^lu-ccM^-regulai^d prolennGPI SlucMe-fi-phos^phate isomeraseVWHAJ 14-3-3 pritfr汩¥BX1 闯血1的竖临的引石世edem&M-biMfi唱protein 1From: C on n e ct i n g the Do ts in the Neur ogl obi n -P rot einIn ter actionNetwork o f an Unstressedand Ferropt ot ic Cel lDeat h Neu robl astom aModel.Co-I P技术疑点分析1、 Co-IP可不可以用珠子做？比如HIs GST的琼脂糖？答：Co-IP是通过磁珠与抗体形成的复合物进行富集，HIs GST的 琼脂糖这些柱料不适用。

2、 请问Co-Ip如何选择合适的Input对照和同型对照？有什么要 求和原则吗？答：Co-IP使用Input阳性对照即可,Input即实验使用的细胞裂 解液3、 互作验证一定要wes tern吗？纯化的蛋白可见呢？答：可见蛋白只能判断蛋白大小，还是需要WB确定就是目的蛋 白4、 Co-IP时，Input的带型不够亮，怎么解决？答：可以瞬转过表达处理5、 两个蛋白，哪个适合ip有要求吗？答：有IP级别抗体的蛋白优先考虑作为诱饵蛋白6、 请问Co-IP，INPUT的加样量是多少？那IgG和IP的上样量 相应有要求吗？答：通常上样量50ug/100ug7、 免疫共沉淀如何避免假阳性？答：Co-IP选择抗体尤为关键，特异性抗体可以排除非特异性结 合进而排除假阳性同时可以结合Co- IP反向验证进一步排除假 阳性若抗体浓度过高，则降低抗体浓度；若抗体特异性不好， 则更换抗体8、 质谱结果几百个怎么分析可能的互作蛋白？答：如果蛋白较多，建议先做功能注释，从中选择与研究方向功 能相关的蛋白；在这些蛋白通过质谱数据（得分）进一步排序， 确认2-3个进行验证9、 请问是不是在不知互作蛋白的情况下，用质谱或其他方法筛 选；如果已知互作蛋白，直接用Co-IP ？答：已知蛋白互作验证CoIP-WB ；未知蛋白互作筛选CoIP-MS。