重组DNA技术（殷）.ppt

重组DNA技术Recombinant DNA technology(基因工程Genetic Engineering)第二十一章一一 目的基因的获取目的基因的获取1.化学合成法要求：已知核苷酸序列或氨基酸序列 1.基因组DNA文库(genomic DNA library)2.cDNA文库(cDNA library)3.聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)（一）化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列基因组DNA (genomic DNA，gDNA) 指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列 （二）从基因组DNA文库获取目的基因限制酶切位点限制酶消化 除去中间片段cos LR coscos L左臂R cos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段 cos LR cos20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库 gDNA文库构建AAAAAAAAAATTTTTTTTTTT逆转录酶Klenow片段 cDNA (complementary DNA)（三）从cDNA文库获取目的基因 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制逆转录酶A A A A T T T T AAAASI核酸酶 DNA聚合酶碱水解 T T T T 人工突变 （四）通过PCR获取目的基因 Agarose Gel ElectrophoresisGel Extraction and DNA Recovery携带目的基因，实现其繁殖或表达所用的DNA。

二二 载体载体克隆载体(cloning vector)使外源DNA被扩增表达载体(expression vector)使外源DNA可转录翻译成 多肽链载体的选择标准：能自主复制；具有遗传标记，便于筛选和鉴定；有多克隆位点（外源DNA插入点；容纳较大外源DNA一）质粒 (plasmid)特点: 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状 噬菌体DNA改造系统 gt系列（插入型，适用cDNA克隆）（二） 噬菌体(phage) M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（三）其他载体常用工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶三三 目的基因与载体的切割目的基因与载体的切割重组DNA技术中常用的工具酶工 具 酶功 能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。

常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease)识别DNA特异序列, 并在识别位点或周围切割双链DNA的内切酶酶 切 反 应 的 基 本 步 骤电泳紫外分析37 1h加反应液CKMBuffer (10X) 2.0 LWater 16.5 LDNA 1.0 LEnzyme 0.5 LVolume 20.0 L 1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT四四 外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接1. 粘性末端连接Bam H切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用 Bam H切割载体DNA用Bam H切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接Eco R切割位点Bg l切割位点+ +EcoR+ Bg l双酶切Eco R+ Bg l双酶切T4 DNA连接酶15C重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。

目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶15C重组体载体自连目的基因 自连2. 平端连接 5335载体DNA5335目的基因限制酶或机械剪切限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 353 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶-核酸外切酶末端转移酶+ dATP末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶15C重组体53. 同聚物加尾连接CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco R4. 人工接头(linker)连接连接反应的条件 酶最适温度为37，但此时氢键不够稳定，且酶活会迅速降低通常在4-15连接影响因素：A. 温度（最主要的因素）B. ATP的浓度C. 连接酶浓度D. 反应时间E. 插入片段和载体片段 的摩尔比转化4 过夜加反应液CK-重组菌落CK+转化 (transformation，DNA导入大肠杆菌)转染 (transfection，DNA导入真核细胞，酵母除外)感染 (infection，噬菌体、病毒感染细胞)五五 重组重组DNADNA导入受体菌导入受体菌1. 直接选择法(1) 抗药性标记选择ampr、tetr 、Kanr(2) 标志补救(marker rescue)， 如互补(3) 分子杂交法2. 免疫学方法（非直接选择法）如免疫化学方法及酶免检测分析等六六 重组体的筛选重组体的筛选(插入失活法) 抗药性标记选择 互补 原位杂交鸡的肌球蛋白的克隆和检出免疫学方法 小结分分离目的基因 切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体 转转入受体细胞筛筛选重组体 重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNA cDNA 人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交构建表达载体受体细胞产物的分离纯化七七 克隆基因的表达克隆基因的表达 选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点1. 原核表达体系 (E.coli最常用)缺乏翻译后加工机制，不宜表达gDNA；缺乏翻译后加工机制，不能加工真核蛋白；蛋白常形成包涵体(inclusion body) ；需要复杂处理方能具有活性。

很难表达大量可溶性蛋白不足大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌 优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、不经济2.真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳类动物细胞）重组人胰岛素生物制药第三节第三节 基因工程的应用基因工程的应用 重组DNA医药产品产 品功 能组织胞浆素原激活剂抗凝血液因子VIII促进凝血颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成促红细胞生成素剌激白细胞生成生长因子(bFGF, EGF)刺激细胞生长与分化生长素治疗侏儒症胰岛素治疗糖尿病干扰素( 1b, 2a, 2b, )抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶抗组织损伤单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗乙肝疫苗(CHO, 酵母)预防乙肝口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱。