金霉素生产菌高速电子流诱变育种与发酵研究.docx

金毒素生产菌高速电子流诱变育种与发醵研究金毒素属四环素类药物,主要抑制敏感微生物的蛋白质合成，其抗菌谱广，对革兰阳性菌、明性菌、螺旋体、立克次氏体、支原体、衣原体、部分原虫等均可抑制金霉素主要与微生物的30S小亚基A位结合，进而干扰氨基酰tRNA与30S小亚基结合，使氨基酰tRNA不能进入mRNA上的受位加制了蛋白质合成时肽链的延长;金霉素还可以阻止已合成的蛋白质肽链释放⑴金毒素对70S核蛋白体的作用更为敏感，因此，金毒素能够选择性抑制敏感微生物，具有一定的安全性能在全球范围内，金霉素是所有饲料药物添加剂中的使用量最大的品种，是国际上重要的兽用抗生素之一金色链霉菌(streptomycesaureofaciens)是金毒素的产生菌，是杜加尔(Duggar)于1948年筛选得到的，具发酵单位只有165U/mL[2].19世纪50年代后，我国实现了金毒素的工业生产高能电子流能诱发DNA点突变和染色体畸变彳导到了成功应用[3]本文通过高能电子流辐射处理金毒素工业产生菌,选育出高产、遗传稳定的菌株，并对发酵工艺进行了研究，以期摸索规律指导工业生产1、材料和方法1.1 菌株出发菌株金色链毒菌(streptomycesaureofaciens)工业生产菌株JH-02由金河生物科技股份有限公司保存提供。

1.2 培养基及培养条件1.2.1 平板培养基(％)小麦粉2硫酸镁0.005磷酸二氢钾0.0L磷酸氢二核0.015,琼脂2.0120℃实消30分钟1.2.2 斜面培养基(％)效皮3.2,硫酸镁0.005磷酸二氢钾0.01磷酸氢二核0.015,琼脂20PH7.4—7.6120℃实消30分钟在温度32℃±0.5℃、相对湿度40-60%条件下培养4天1.2.3 种子培养基(％)玉米淀粉4黄豆粉2Q蛋白粉05酵母粉0.5,碳酸钙0.4,硫酸核0.3,氯化钠02硫酸镁0.025,磷酸二氢钾0.025,培养基装量25ml/250ml三角瓶,120℃实消30分钟在温度30℃±0.5℃下培养22—26小时1.2.4 发酵培养基(％)玉米淀粉10,花生粉15黄豆粉25淀粉酶0.004,氯化钠0.25,硫酸核0.5,碳酸钙0.7,蛋白粉14酵母粉02硫酸镁0.025,豆油1.25ml/25ml，培养基装量25ml/250ml三角瓶,120℃实消30分钟在温度30℃±0.5℃条件下培养5天13高能电子流诱变高能电子流发射器为BF-5电子直线加速器(E=5MeV,I=100uA),由北京师范大学低能核物理研究所提供。

培养4天的新鲜斜面用15ml0.2%的葡萄糖液洗脱成熟抱子,倒入玻璃大试管中32℃振摇3小时振摇结束后加100ml无菌盐水制成单泡子悬浮液(>108个/ml),分装5ml于玻璃管中低温状态下送到北京师范大学低能核物理所用高能电子流进行诱变每剂量组9瓶：A组:束流2X10-7A吸收剂量10GY/S从5秒-90秒共9个照射时间梯度B组:束流3X10-7A吸收剂量15GY/S从5秒-90秒共9个照射时间梯度辐射后立即稀释涂平板1.4 50L发酵罐放大实验将复筛得到的高产菌株与出发菌株JH-02分别接种于斜面培养基,34℃,培养4〜5天从成熟的斜面上刮取抱子，接种到5L种子罐培养基中,32℃,150r7min,培养24小时以10%的接种量将种子培养液转接于50L发酵罐中,32℃,280r/min,培养120小时1.5 发酵效价测定化学测定法利用金毒素在酸性溶液中经加热后能脱去一分子水，生成黄色的脱水金毒素，其色度与含量成正比此性质符合郎伯-比耳定律，故利用比色法来测定其效价发酵液经草酸酸化过滤后，吸1ml滤液于9ml蒸窗水中，分别吸取1ml稀释滤液于2只50ml装有5ml2mol盐酸的容量瓶中，一只用作CK,另一只于沸水煮沸5分钟，冷却后加水定容至刻度，摇匀后于721—B型分光光度计、波长440nm、光程1cm测定。

1.6 菌体浓度的测定采用离心法测定先测离心管的重量W0,然后取10ml发酵液加入离心管，测定总质量W1,离心(2000r/minx3min),弃上清，测定沉淀物及管总质量W2根据公式计算菌体浓度菌体浓度=1.7 总糖含量的测定：见文献［4］1.8 菌体粘度的测定：玻璃毛细管粘度计测定［5］2、结果分析2.1 高能电子流对菌株抱子的致死效应将处理好的泡子液，稀释成一定的梯度浓度，涂布在分离平板上，在温度32℃±0.5℃、相对湿度40-60%条件下培养2-3天，计算诱变死亡率由表1可以看出JH-02对于高能电子流辐射表现出高度的敏感性,致死率与辐射剂量、辐射时间成正比2.2 摇瓶筛选结果出发菌株JH-02经高能电子流处理后，初筛得到35株新菌株，进一步复筛得到1株金毒素产量明显提高的菌株:D-23将D-23菌株连续传5代（表1）菌株D-23产素能力平均为21145u/ml,与JH-02发酵单位（u/ml）相比提高了13.1%2.3 放大实验中新菌株与原始菌株生理生化特性的比较将高产菌株D-23与出发菌株JH-02分别在50L发酵罐中进行放大实验，对发酵过程中两菌株的物理、生物、化学等参数进行比较，结果如下。

2.3.1 生长特性的比较：AJH-02菌体浓度，■:D-23菌体浓度，△:JH-02发酵液粘度,d:D-23发酵液粘度图1JH-02与D-23菌体浓度及发酵液粘度的比较Fig.1 ConstractoftheMyceliumConcentrationandtheVisciditybetweenJH-02andD-23在发酵过程中,D-23的菌体浓度比JH-02高5~10%发酵中后期JH02的粘度迅速降至2s,而D-23仍可保持较高粘度,表明其菌体仍保持一定活力（见图1）AJH-02■:D-23图2JH-02与D-23溶解氧的匕瞰Fig.2 ConstractofDObetweenJH-02andD-23在发酵过程中，特别是在产素集中的中期发酵过程中,D-23的DO明显低于3-02,表明其需氧增强，菌体代谢的活力明显高于JH-022.3.2发酵过程曲线的比较：在发酵前期Q-23与出发菌株的糖代谢速率基本一致，产物合成速率也基本一致;发酵中期，与出发菌株相比,D-23菌株活力较强，底物消耗速率略高于出发菌株，产物合成速率也明显高于出发菌株（见图3）发酵结束时，出发菌株JH-02的金毒素产量为18905u/ml,D-23为21060u/ml,比出发菌株高11.4%。

AJH-02糖代谢率，■:D-23糖代谢率，△:JH-02产物合成速率,□:D-23产物合成速率图3JH-02与D-23发酵过程曲线的比较Fig.4ConstractoftheFermentationCurvebetweenJH-02andD-23通过以上实验验证结果标明高能离子流处理的突变菌株D-23的稳定性和产素能力都明显优于出发菌株JH-023、分析讨论近年来，出现了一维型的诱变方法用于微生物的诱变育种，如微波、红外射线、激光、高能电子流、离子注入等,诱变生物学效应匕瞰明显由于金色链霉菌代谢复杂QNA链结合紧密,所以用常规的处理方法及诱变剂效果不太明显高能电子流是具有相当能量的粒子流，带有负电荷，它射入生物体时，可以直接使遗传物质电离，引起DNA互补链的氢键破裂，也能引起DNA双链和单链的断裂，在微生物自身修复机制的作用下，会引起微生物DNA点突变和染色体畸变［6］由于金霉素产生菌株对高能电子流比较敏感,致死率与剂量和照射时间成正比,故而为了得到大量的诱变体，用于照射的泡子液应该有较高的浓度,同时在比较合适的剂量下,照射时间在30-60秒得到的诱变体数量较为合适实验证明高能电子流照射金霉素生产菌株是一种行之有效的诱变方法。

半个世纪以来，我国已经成为世界上最大的金毒素生产国，拥有3个规模较大的生产厂家.截至2005年，金毒素发酵单位产量为23000U/mL,但距离国外最高发酵单位30000U/mL还有很大差距经过多年传统方法的菌种，金霉素的发酵水平一直没有大的突破［刀筛选得到的高产菌株D-23比出发工业生产菌株JH-02的摇瓶效价提高13.1%,并且传代稳定，发酵过程代谢能力增强，产素能力提高,工厂生产已经推广金色链霉菌通过高能电子流照射实现DNA的断裂和重组，虽然其产素能力有所提高，但是DNA断裂和重组位点不明确，其真正的代谢调控机制还是一个空白此外，是否能够通过基因工程的方法实现金色链霉菌DNA的重组都是我们值得进一步研究的课题生物发酵工业，工厂规模化生产过程中，淀粉单耗一直是一个重要的经济指标,控制生产菌的代谢，加大糖代谢，减少残糖含量一直困扰着成本指标D-23以期优异的糖代谢水平初步解决了残糖的控制由于其发酵中后期较高的糖代谢率，使补料消耗比较充分，比较明显的降低了单耗指标感谢您的阅读!。