玉米赤霉烯酮降解酶多拷贝表达载体构建及其毕赤酵母高效表达.doc

多拷贝玉米赤霉烯酮降解酶在毕赤酵母的 分泌表达 王义春 江均平（农业部农产品加工综合性重点实验室，中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193）摘要：本研究通过多拷贝克隆技术实现玉米赤霉烯酮（Zearalenone, ZEN）降解酶基因（zlhy-6）在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达基因序列根据酵母密码子偏爱性优化后与α因子信号肽编码序列一起合成（即α-zlhy-6），插入到 pA0815 中，并构建 pA0815-（α-zlhy-6）4 多拷贝表达载体，转化毕赤酵母 GS115 后进行诱导表达，并对表达产物进行鉴定结果表明，酶切证实成功构建了α-zlhy-6多拷贝毕赤酵母表达载体 pAO815-（α-zlhy-6）4，利用 SDS-PAGE 法检测到表达产物在 30 kDa 附近出现条带，与预期值相符活性测定表明重组酶具有较高降解 ZEN 的能力重组酶对水溶液中 ZEN 的降解率可达到 97.5% 以上，对玉米碴中 ZEN 的降解率达到 75.51% 左右关键词：玉米赤霉烯酮；降解；基因表达；毕赤酵母Construction of a Multi-Copy Secretory Expression Vector and Expression of ZEN Degradation Enzyme in Pichia pastoris Wang Yichun, Jiang Junping(Key Laboratory of Agro-Products Processing, Ministry of Agriculture, Institute of Agro- Products Processing Science Degradation; Gene expression; Pichia pastoris; 玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)，又称F-2毒素，2,4-二羟基苯甲酸内酯类化合物，主 要由禾谷镰刀菌产生的一种霉菌毒素。

ZEN具有雌激素活性，对生殖发育系统有毒害作用 摄入ZEN超标的母猪会出现外阴和乳腺肿大甚至阴道及直肠脱垂的症状[1]ZEN有致癌性， 能导致DNA收敛、染色体断裂[2]，还可能通过雌激素受体通路和抑制凋亡促进人神经母细 胞瘤 SK-N-SH 细胞的体外增殖[3]Jian Ying等[4]研究发现ZEN能导致老鼠变态数精子增 加、精子的活力下降同时受孕降低梁梓森等[5]研究证明ZEA有血液毒性，小鼠试验中， 通讯作者，E-mail: 1367858907@.com Correspondence author ,通讯作者， E-mail: 1367858907@.comZEN可导致淋巴细胞明显减少(P<0.05)，白细胞及其他各组分细胞升高，血小板数量明显减 少 目前ZEN的降解方法主要有物理法（高压加热[6]、辐照[7]、吸附剂吸附[8]） 、化学法 （加臭氧、双氧水和碳酸钠处理[9-11]）和生物法（微生物菌体吸附、酶降解） 传统的物理 化学方法有一定局限性，如破坏营养物质、引入化学物质造成再次污染等而生物学方法 具有反应条件温和、无化学试剂残留等优点，因此受到人们广泛关注近年来，随着生物 技术的发展，ZEN的生物降解有了一定进展。

不少能降解ZEN的菌被分离找到，其中一些 关键酶的基因已被克隆表达来自粉红粘帚霉的ZEN降解酶基因zhd101、zlhy-6、ZEN-jjm 被成功克隆表达，重组蛋白均表现出较强的水解ZEN的能力[12-15]，被转入ZEN降解酶基因 的玉米也表现出降解ZEN的能力[16]Tang等从一株不动杆菌成功克隆了一个抗氧化酶基因， 重组酶有降解ZEN的能力，一定浓度H2O2能提高其水解ZEN的能力[17]外源基因在酵母中的表达水平的高低受诸多因素的影响其中，密码子的偏好性和基 因表达量密切相关，在宿主菌中表达量高的基因通常采用宿主菌所偏爱的密码子Andrea Mellitzer等[18]研究表明，使用不同的密码子，外源基因的表达量不同此外，外源基因的 表达量与其在宿主中的基因拷贝数也密切相关，一般情况下, 毕赤甲醇酵母中外源基因整 合的拷贝数愈多蛋白表达量愈高 巴斯德毕赤酵母表达系统是目前使用最多、最广泛，被认为最理想的生产外源蛋白的 工具之一，已成功表达1000多种外源蛋白 [19-20] 毕赤酵母表达载体pAO 815是常用的胞内表达载体，它能实现体外构建多拷贝，即在构建表达载体上，就含有多个拷贝的外源基 因，提高整合时产生多拷贝的概率，从而提高目标蛋白的表达量。

但是，该载体没有分泌 信号，其表达产物存在于酵母细胞内，不但容易被降解，也不便于分离和纯化为得到一 个表达量更高、产物更易于分离纯化的ZEN降解酶表达系统，本试验以zlhy-6为目标基因， 对pAO 815 和外源基因进行改造和构建1 材料与方法 1.1 材料1.1.1质粒和菌株基因 zlhy-6 按酵母偏爱密码子进行优化，由无锡青兰生物技术有限公司合成；E. coli TOP10 感受态细胞，购自北京全式金公司；酵母表达载体 pAO815、Pichia pastoris GS115，由本实验室保存 1.1.2 试剂限制性内切酶(EcoRⅠ、BglⅡ、BamHⅠ、SalⅠ)、PfuDNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶 等，日本 TaKaRa 公司；PCR 产物纯化试剂盒、DNA 胶回收试剂盒，北京三博远志公司； YNB， BD 公司；D-山梨醇，德国 Sigma 公司；乙腈、甲醇（色谱级） ，美国 Fisher 公司； 其他分析纯试剂，国药集团化学试剂有限公司1.1.3 仪器与器材紫外凝胶成像仪，美国 Alpha Innotech 公司；凝胶电泳仪，北京百晶生物技术有限公 司；高速冷冻离心机，德国 Eppendorf 公司；PCR 扩增仪，日本 TAKARA 公司；高效液相 色谱仪，美国 Waters 公司；C18 液相色谱柱，美国 Agilent 公司；电击转化仪，美国 BTX 公司；恒温振荡摇床，上海智诚公司。

1.2 方法1.2.1 表达载体的构建1.2.1.1 单拷贝表达载体构建 利用化学方法合成 α 信号肽编码序列和玉米赤霉烯酮降解酶基因 zlhy-6，即 α-zlhy-6， 并在基因两端引入 EcoRⅠ酶切位点其中，ZEN 降解酶基因按照酵母密码子偏爱性进行 优化合成的基因片段和载体 pAO815 用 EcoRⅠ酶切处理，并用凝胶回收试剂盒进行纯化 回收酶切体系 20 µL：质粒或目的片段 10 µL，10×H Buffer 2 µL，EcoRⅠ1 µL，ddH2O 7 µL体系混匀后 37 °C 反应 3 h 回收的目的片段和载体按摩尔比3：1用T4连接酶进行连接连接反应体系10 µL：目的 片段3 µL，载体4 µL，10×T4 连接酶缓冲液1 µL，T4连接酶1 µL，16 °C连接过夜，连接产 物转化大肠杆菌TOP10，用氨苄青霉素筛选阳性克隆然后测序，选择插入pAO815的α- zlhy-6为正向的克隆得到的重组质粒(pA0815 l×α-zlhy-6)作为α-zlhy-6表达框(5’AOX-α- zlhy-6-3’AOX-TT3’) 的来源用于构建后面的多拷贝表达质粒 1.2.1.2 多拷贝表达质粒的构建 引物 P1/P2：GGAAGATCTAACATCCAAAGACG/ TAGGATCCGCACAAACGAAC，引 物两端引入了 BglⅡ、BamHⅠ酶切位点。

以重组质粒 pA0815 l×α-zlhy-6 为模板，用引物 P1/P2 PCR 扩增得到完整表达框 5’AOX-α-zlhy-6-3’AOX-TT3’PCR 反应条件：95 ℃预变 性 5 min， （95 °C 30 s，56 °C 30 s，72 °C 60 s）共 35 个循环，72 °C 延伸 7 min试剂盒纯 化回收扩增产物并连接到 pGM-T 载体上，转化后，过夜培养，挑取 6 个阳性克隆，经测 序与合成基因片段一致连接到 pGM-T 的表达框经 BglⅡ、BamHⅠ双酶切后，试剂盒回 收得到的表达框与经 BamHⅠ酶切处理并用 CIP 去磷酸化的单拷贝 pA0815 表达载体连 接，转化 TOP10，提质粒酶切鉴定筛选到 2 拷贝质粒 pA0815 2×α-zlhy-6用BglⅡ、BamHⅠ双酶切 2 拷贝质粒，回收得到两个串联的表达框，再与经 BamHⅠ酶切处 理并用 CIP 去磷酸化的质粒 pA0815 2×α-zlhy-6 连接，转化 TOP10，提取质粒进行酶切鉴定1.2.2 重组表达载体转化毕赤酵母 GS1151.2.2.1 毕赤酵母 GS115 感受态的制备 酵母 GS115 单菌落转移到 5 ml YPD 培养基中，30 °C，250 r/min 过夜培养。

取 100 µL 过夜培养液于 50 mL 新鲜 YPD 培养基中，30 °C，250 r/min 培养至 OD600=1.3~1.5（12~16 h） 4 °C、5000 g 离心 5 min 收集菌体；50 ml 预冷蒸馏水洗涤一遍，5000 g 离心 5 min 收 集菌体；加入 50 ml LiAc-DTT 溶液（100 mM LiAc，10 mM DTT，0.6 M 山梨醇，10 mM Tris-HCl，pH 7.5）混匀，室温下放置 30 min，5000 g 离心 5 min，菌体用 5 mL 冰浴的 1 M 山梨醇洗涤两次，最后 1.5 mL 1M 山梨醇重悬，按每管 80µL 分装 1.2.2.2 线性化重组质粒的电击转化 构建好的表达载体 pA0815 4×α-zlhy-6 用 SalⅠ线性化后回收取 1~5 µg 与 80 µL 感受 态细胞转入 0.2 cm 电击杯中混匀，冰浴 5 min 进行转化，同时以空载体 pA0815 作阴性对 照电转条件：电压 1.5 kV，电容 25 µF，电阻 200 Ω电击后立即加入 1 mL 冰浴的 1M 山梨醇，转入 1.5 mL 离心管，30 °C 孵育 1 h。

取菌悬液 20 µL 涂布于 MD 平板，将平板倒 置于 30 °C 培养 3 d，观察转化子1.2.3 重组蛋白的诱导表达筛选及鉴定随机挑取 MD 平板上的单菌落分别接种于 5 mL BMGY 培养基中，30°C、250 r/min 培 养 36 h，5000 g 室温离心 5 min 收集菌体菌体用 2 ml BMMY 培养基重悬，30 °C、250 r/min 诱导培养 3 d，期间每隔 24 h 补加甲醇至 0.5%，培养结束后，12000 g 离心 5 min 收 集上清液进行 SDS-PAGE 电泳筛选重组蛋白由北京蛋白组研究中心采用串联质谱（MS-MS）进行分子鉴定1.2.4 重组蛋白诱导时间和表达量分析成功表达重组蛋白的酵母接种于 50 mL BMGY 培养基中，30 °C、250 r/min 培养 OD600 至 2~6，收集菌体将菌体转移至 20 mL BMMY 培养基中，30 °C、250 r/min 诱导培养 5 d，期间每隔 24 h 取样，并补加甲醇至终浓度 0.5%取 15 µL 样品进行 SDS-PAGE 检测， 利用凝胶图像分析软件 BandScan 5.0 对重组蛋白的总灰度进行分析。

将诱导培养 1 d 的蛋 白的灰度值设为 100，计算其余时间的蛋白灰度值的相对变化率 1.2.5 重组蛋白 ZEN 降解活性分析1.2.5.1 水溶液中 ZEN 的降解 取成功表达蛋白和对照菌株的酵母上清液对 ZEN 进行降解反应体系 500 µL：上清 液 50 µL；0.5 mg/mL ZEN 20 µL； 0.05 M Tris-HCl（pH7.5）470 µL反应体系混匀后 37 ° C 反应 0~2 h 加入等体积甲醇终止反应。