小分子肝素的制备.ppt

LOGO小分子肝素小分子肝素小分子肝素小分子肝素的制备的制备的制备的制备陈紫娟LOGO目目目目 录录录录概述概述1制备方法制备方法2酶活测定方法及分子量测定方法酶活测定方法及分子量测定方法3实验进度及问题实验进度及问题LOGO1 1 1 1 概述概述概述概述v肝肝素素（（Unfractionated heparin,UFH））作作为为抗抗凝凝剂剂和和抗抗血血栓栓药药在在临临床床上上使使用用已已有有60余余年年，，但但长长期期使使用用会会导导致致出血和血小板减少等不良现象出血和血小板减少等不良现象v低低分分子子肝肝素素(Low-molecular-weight heparin,LMWH)是是由由普普通通肝肝素素裂裂解解而而来来与与普普通通肝肝素素比比较较，，其其抗抗血血栓栓能能力力较较强强而而抗抗凝凝血血能能力力较较低低，，在在其其抗抗血血栓栓能能力力形形成成时时对对凝凝血血系系统统的的影影响响较较小小另另外外低低分分子子肝肝素素还还具具有有分分子子量量小小、、生生物物利利用用度度高高、、体体内内半半衰衰期期长长、、出出血血倾倾向向小小等等特特点，因此低分子肝素的制备具有重要的意义。

点，因此低分子肝素的制备具有重要的意义LOGO v根据其末端链的差异和制备方法的不同，低分子肝素主要分为八种 平均分子量平均分子量制备方法制备方法FXa/ /FⅡa的比例的比例末端链末端链那屈肝素依诺肝素达肝素舍托肝素亭扎肝素瑞维肝素阿地肝素帕肝素45003500-50004000-60004500-80004900400060005000亚硝酸降解 乙醇分级苯甲化并碱降解亚硝酸降解 凝胶过滤亚硝酸异戊酯降解肝素酶降解亚硝酸降解过氧化氢降解过氧化氢降解3.63.82.04.21.95.01.92.02，5-脱水-D-甘露糖还原末端4，5-不饱和糖醛酸非还原末端2，5-脱水-D-甘露糖还原末端2，5-脱水-D-甘露糖还原末端4，5-不饱和糖醛酸非还原末端2，5-脱水-D-甘露糖还原末端不稳定的糖苷键不稳定的糖苷键LOGO2 2 2 2 制备方法制备方法制备方法制备方法化学裂解法化学裂解法亚硝酸降解法、过氧化氢降解法、β-消除降解法和其它化学降解法 制备方法制备方法物理分离法物理分离法有机溶剂分级沉淀法、凝胶色谱法、亲和色谱法、离子交换色谱法和超滤法 （不适用与工业化生产）酶解法酶解法肝素酶LOGOv2.1.1亚硝酸降解法亚硝酸降解法肝素钠肝素钠 溶液溶液 降解液降解液 中和液中和液 沉淀沉淀 低分子肝素低分子肝素2.1 2.1 2.1 2.1 化学降解法化学降解法化学降解法化学降解法1%醋酸PH 2.3-3.0亚硝酸钠-5～30℃，3.5h氢氧化钠中和PH 6.5-7.0无水乙醇丙酮脱水，干燥该解聚肝素的过程受温度、溶液该解聚肝素的过程受温度、溶液pH值、亚硝酸盐的浓度及降解值、亚硝酸盐的浓度及降解时间的影响较大。

时间的影响较大 LOGO2.1 2.1 2.1 2.1 化学降解法化学降解法化学降解法化学降解法v2.1.2 过氧化氢降解法过氧化氢降解法 肝素钠肝素钠 溶液溶液 溶液溶液 反应液反应液 浓缩液浓缩液 中和液中和液 沉淀沉淀 低分子肝素低分子肝素 该法制备该法制备LMWH 的过程也主要受反应的温度、的过程也主要受反应的温度、pH值和过氧化氢浓度的影值和过氧化氢浓度的影响响 乙酸钠PH 7.8 抗坏血酸、乙酸铜水溶液PH 7.8边搅拌边加入过氧化氢PH 7.8，40℃，24h真空浓缩EDTA钠盐PH 6.5-6.7无水甲醇干燥LOGO2.1 2.1 2.1 2.1 化学降解法化学降解法化学降解法化学降解法v2.1.3 β-2.1.3 β-消去降解法消去降解法 β-消除降解法包括肝素季铵化和降解两步处理。

肝素的季铵盐和卤代烃或卤代苄基化合物在二氯甲烷或二甲基甲酰胺中可以发生酯化反应,生成的肝素酯可在碱性条件下水解成LMWH 肝素解聚程度可由酯化率，碱性条件或酯的类型决定v2.1.42.1.4其它化学降解法其它化学降解法v除亚硝酸降解、β-消除降解法和过氧化氢降解这三种工业上用来制备LMWH的化学方法以外，还可采用高碘酸降解、次氯酸降解、γ-照射和硫酸一氯磺酸降解等几种方法制备LMWH这几种制备方法目前没有其投入工业化生产的报道 LOGO2.1 2.1 2.1 2.1 化学降解法化学降解法化学降解法化学降解法v优点：化学裂解法工艺简单，成本低廉，适宜工业化生产v缺点：化学裂解法在裂解过程中容易导致硫酸基丢失ATlll一结合部位减少，同时其在裂解过程中易引入有毒物污染环境LOGO2.2 2.2 2.2 2.2 酶解法酶解法酶解法酶解法v肝素的酶法降解己经被用作分析肝素的结构和制备LMWH肝素酶是能特异性的裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，最初是从肝素黄杆菌（Flavobacterium heparinum）中发现并分离后在一些其它的微生物和真核生物中也有发现，如拟杆菌属、棒杆菌属和芽孢杆菌属等几种，真核生物的霉菌、胎盘、胸腺、血小板等中均有发现。

v肝素酶主要用于低分子肝素生产和链上精确结构的研究，现在市场上肝素酶价格昂贵且都是肝素黄杆菌肝素酶，这是由于分离肝素酶稳定性差及产量不高所造成的LOGO2.2 2.2 2.2 2.2 酶解法酶解法酶解法酶解法微生物微生物微生物微生物微生物微生物方法方法方法方法方法方法构建高效表达且不易产生包涵体的基因工程菌基因工程基因工程基因工程基因工程基因工程基因工程方法方法方法方法方法方法相较化学裂解法，酶解法裂解环境温和、对环境无污染，但目前市场上售卖肝素酶，价格昂贵，且均是肝素黄杆菌肝素酶为了降低肝素酶的价格，可尝试以下三条途径：筛选新的高效产酶菌株生化生化方法方法进一步研究肝素酶的结构、性质，提高分离纯化效率LOGO3 3 低分子的测活方法及低分子的测活方法及低分子的测活方法及低分子的测活方法及分子量的测定分子量的测定分子量的测定分子量的测定天青天青A法法血浆凝固法血浆凝固法生色底物法生色底物法可以测定低分子肝素含量但却无法反应LMWH的抗Xa因子和抗IIa因子活性，因为失活的肝素同Azure A仍可显色, 证明现有理化方法测得的肝素化学等效性并非生物等效性 凝固法用血浆做底物,血浆存在较大的差异,本身就可带入试剂误差;用人眼观察凝块出现时间,造成人为误差;采用标准曲线计算效价,也存有统计误差。

　它在效价测定中的特异性,分光光度法的使用使常规测定自动化、标准化 3.1 酶活测定酶活测定LOGO3.1 3.1 低分子的测活方法低分子的测活方法低分子的测活方法低分子的测活方法v活性测定时不能简单的套用理化法的实验设计标准曲线法,而应采用生物测定的量反应平行线法,而生物测定的实验误差比理化测定大,有各种无法控制的随机因素所引起的差异，在检测LMWH效价时可尝试结合理化测定方法和生物测定方法LOGO3.2 3.2 低分子肝素的分子量测定低分子肝素的分子量测定低分子肝素的分子量测定低分子肝素的分子量测定用于LMWH分子量测定的方法有粘度法、低压排阻色谱法、高效排阻色谱法(HPEC)、超速离心法、光散射法、梯度聚丙烯酞胺凝胶电泳(PAGE)法等测定方法优点缺点粘度法HPEC法梯度PAGE法仪器简单，不需要对照品本法重现性好，速度快，能测平均分子量，能测分子量分布样品和标准品在一个凝胶上同时进行电泳，测定结果较为准确；在同一凝胶上可同时测多个样品PAGE结果拍成照片后可保存；可同时测得分子量分布、重均分子量对条件要求苛刻，微小的误差（如温度、粘度计的清洁度），就能引起较大的结果差异，另外此法只能测定平均分子量，而无法测定LMWH的分子量分布。

需用测分子量的LMWH标准品进行校正操作较繁琐，耗时较长；在测定结果方面，由于较小分子量的低分子肝素组分着色很浅或很小的难着色，测得的分子量较HPEC法偏高LOGO4 4 实验进度及问题实验进度及问题实验进度及问题实验进度及问题4.1拟完成的内容：（1）比较几种测定低分子肝素活性的方法（天青A、血浆凝固法、生色底物法），建立测活有效方案2）探索制备低分子肝素的最佳方案3）试图筛选新的产肝素酶的微生物、优化发酵条件并分离纯化该肝素酶LOGO4.2 4.2 已完成的内容已完成的内容已完成的内容已完成的内容v已完成内容：v（1）筛选到两株产肝素酶的菌株并制得粗酶液v（2）对影响天青A测酶活方法的因素（测活时间、pH、离子浓度、金属离子、一些化学物质）进行了研究LOGO4.3 4.3 目前遇到的困难及解决问题方案目前遇到的困难及解决问题方案目前遇到的困难及解决问题方案目前遇到的困难及解决问题方案 v（1）在天青A测酶活的过程中，发现离子强度对该法测酶活的稳定性影响较大，易出现假阳性现象另外该法在建立标曲的时，线性关系不是很好v鉴于天青A法测得的肝素化学等效性并非生物等效性，拟采用药典上的血浆凝固法和生色底物法测酶活。

v（2）提取粗酶液后，测得酶活较小和测得的蛋白质含量也较小推测可能是菌体量太少v尝试采用发酵罐发酵获得大量菌体，来提高所需的肝素酶的含量，或者考虑构建产酶工程菌LOGOAdd your company 。