造血干细胞定向分化扩增与移植课件.ppt

生物技术学院生物治疗研究所生物技术学院生物治疗研究所李李 妍妍造血干细胞定向分化扩增与移植造血干细胞定向分化扩增与移植追溯干细胞的发现史追溯干细胞的发现史n n18681868年，德国生物学家年，德国生物学家年，德国生物学家年，德国生物学家Ernst HaeckelErnst Haeckel第一次利用第一次利用第一次利用第一次利用“ “干细胞干细胞干细胞干细胞” ”一词来一词来一词来一词来描述描述描述描述受精卵受精卵受精卵受精卵（（（（fertilized egg or zygotefertilized egg or zygote）n n19811981年起，研究人员长期致力于小鼠胚胎干细胞研究工作年起，研究人员长期致力于小鼠胚胎干细胞研究工作年起，研究人员长期致力于小鼠胚胎干细胞研究工作年起，研究人员长期致力于小鼠胚胎干细胞研究工作n n19981998年，研究人员首次分离出年，研究人员首次分离出年，研究人员首次分离出年，研究人员首次分离出小鼠胚胎干细胞小鼠胚胎干细胞小鼠胚胎干细胞小鼠胚胎干细胞(embryonic stem (embryonic stem cell)cell)n n￿ ￿ ￿ ￿20062006年年，，日本首次日本首次诱导诱导小鼠胚胎成纤维细胞小鼠胚胎成纤维细胞成为成为多能干细胞，并命多能干细胞，并命名为名为iPS （（induced￿pluripotent￿stem￿cellinduced￿pluripotent￿stem￿cell））￿ ￿。

n n20072007年年年年1111月，美国和日本同时宣布将人体皮肤细胞诱导成了月，美国和日本同时宣布将人体皮肤细胞诱导成了月，美国和日本同时宣布将人体皮肤细胞诱导成了月，美国和日本同时宣布将人体皮肤细胞诱导成了iPSiPS干细胞干细胞(stem cell, SC)研究研究n成为继人类基因组大规模测序之后最具活力、最有影响和最有应用前成为继人类基因组大规模测序之后最具活力、最有影响和最有应用前景的景的生命学科生命学科研究领域研究领域n￿ ￿1999年年, 2000年连续两年被美国年连续两年被美国《《Science》》杂志评为本年度十大科杂志评为本年度十大科学成就之一学成就之一n2001年被列入当今六大热门科技研究领域之一年被列入当今六大热门科技研究领域之一￿ ￿ ￿ ￿n2008 年年《《Cell Stem Cell》》创刊仅创刊仅2年年,影响因子（影响因子（impact factor，，IF)从从0冲至冲至16.826 23.563（（2009年）年）￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿25.943（（2010年）￿￿￿￿￿￿￿￿胚胎干细胞胚胎干细胞 (embryonic stem cell(embryonic stem cell，，EC)EC) 成体干细胞成体干细胞 (somatic stem cell)(somatic stem cell)(somatic stem cell)(somatic stem cell)：：：： 干细胞分类干细胞分类造血干细胞造血干细胞造血干细胞造血干细胞神经干细胞神经干细胞神经干细胞神经干细胞肌肉干细胞肌肉干细胞肌肉干细胞肌肉干细胞…………胚胎干细胞胚胎干细胞胚胎干细胞胚胎干细胞神经干细胞神经干细胞神经干细胞神经干细胞光学显微镜下的神经（左）和肌肉（右）干细胞光学显微镜下的神经（左）和肌肉（右）干细胞光学显微镜下的神经（左）和肌肉（右）干细胞光学显微镜下的神经（左）和肌肉（右）干细胞按按按按发育发育发育发育状态状态状态状态unipotentunipotentunipotentunipotent（单能）（单能）（单能）（单能）: somatic SC: somatic SC: somatic SC: somatic SC干细胞分类干细胞分类按按按按分化分化分化分化潜能潜能潜能潜能Totipoent (Totipoent (Totipoent (Totipoent (全能全能全能全能):ES):ES):ES):ESpluripotentpluripotentpluripotentpluripotent（多能）（多能）（多能）（多能）:somatic SC:somatic SC:somatic SC:somatic SCWhere we find somatic SC?musclesskinsurface of the eye brainbreastintestines (gut)bone marrowtesticlesThere are There are There are There are other tissues and organsother tissues and organsother tissues and organsother tissues and organs containing somatic SC except for above containing somatic SC except for above containing somatic SC except for above containing somatic SC except for above mentioned. mentioned. mentioned. mentioned. Somatic stem cells:Haematopoietic stem cells (HSCs)诱导性多功能干细胞诱导性多功能干细胞诱导性多功能干细胞诱导性多功能干细胞( ( ( (induced pluripotent stem cellinduced pluripotent stem cell，，iPSiPS ) ) ) ) 20062006年日本首次通过逆转录病毒将年日本首次通过逆转录病毒将4 4个转录因子即个转录因子即 Oct3/4Oct3/4、、Sox2Sox2、、c-Myc c-Myc 及及Klf4Klf4导入小鼠胚胎成纤维细胞（导入小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblastmouse embryonic fibroblast，，MEFMEF）获得一）获得一种多能干细胞，并命名为种多能干细胞，并命名为iPSiPS。

2007200720072007年年年年11111111月，美国和日本同时宣布将月，美国和日本同时宣布将月，美国和日本同时宣布将月，美国和日本同时宣布将人体皮肤细胞人体皮肤细胞人体皮肤细胞人体皮肤细胞(skin cell)(skin cell)(skin cell)(skin cell)改造成了改造成了改造成了改造成了iPSiPSiPSiPS adult cell‘genetic reprogramming’= add certain genes to the cellinduced iPS behaves like an ES iPS : no need for embryos! 干细胞的端粒酶（干细胞的端粒酶（telomerase））n n普通细胞受到端粒普通细胞受到端粒(telomere)(telomere)的限制，在经历一定次数的的限制，在经历一定次数的分裂后就会死亡细胞的分裂后就会死亡细胞的DNADNA复制机器无法达到复制机器无法达到DNADNA链链的最顶端，因此随着每次细胞分裂端粒会逐渐缩短的最顶端，因此随着每次细胞分裂端粒会逐渐缩短n n而干细胞中包含一种而干细胞中包含一种端粒酶端粒酶，能够构建端粒备份，使细胞，能够构建端粒备份，使细胞获得永生。

获得永生 干细胞的应用干细胞的应用“ “制造或再生制造或再生制造或再生制造或再生” ”器官器官器官器官，为细胞治疗、组织替代治疗、器官移植等提供新，为细胞治疗、组织替代治疗、器官移植等提供新，为细胞治疗、组织替代治疗、器官移植等提供新，为细胞治疗、组织替代治疗、器官移植等提供新的技术途径的技术途径的技术途径的技术途径与基因工程技术相结合，利用基因与基因工程技术相结合，利用基因与基因工程技术相结合，利用基因与基因工程技术相结合，利用基因定点缺失定点缺失定点缺失定点缺失与与与与突变突变突变突变等进行更加有效的等进行更加有效的等进行更加有效的等进行更加有效的基基基基因治疗因治疗因治疗因治疗，，，，为疾病、创伤、衰老和遗传等因素所致的组织器官损伤或功能为疾病、创伤、衰老和遗传等因素所致的组织器官损伤或功能为疾病、创伤、衰老和遗传等因素所致的组织器官损伤或功能为疾病、创伤、衰老和遗传等因素所致的组织器官损伤或功能障碍的治疗提供了新的思路障碍的治疗提供了新的思路障碍的治疗提供了新的思路障碍的治疗提供了新的思路解决人类面临的大多数解决人类面临的大多数解决人类面临的大多数解决人类面临的大多数医学难题医学难题医学难题医学难题，如心血管疾病、自身免疫性疾病、糖，如心血管疾病、自身免疫性疾病、糖，如心血管疾病、自身免疫性疾病、糖，如心血管疾病、自身免疫性疾病、糖尿病、骨质疏松、恶性肿瘤、老年性痴呆、帕金森病、严重烧伤、脊髓尿病、骨质疏松、恶性肿瘤、老年性痴呆、帕金森病、严重烧伤、脊髓尿病、骨质疏松、恶性肿瘤、老年性痴呆、帕金森病、严重烧伤、脊髓尿病、骨质疏松、恶性肿瘤、老年性痴呆、帕金森病、严重烧伤、脊髓损伤和遗传性缺陷等疾病的治疗。

损伤和遗传性缺陷等疾病的治疗损伤和遗传性缺陷等疾病的治疗损伤和遗传性缺陷等疾病的治疗Stem Cells: Stem Cells: Flexible friendsFlexible friends. Nature 2012 ,Mar 1,483:S22. Nature 2012 ,Mar 1,483:S22–S26. S26. DOI: doi:10.1038/483S22aDOI: doi:10.1038/483S22a我国建成世界最大人胚胎干细胞库 我国建成世界最大人胚胎干细胞库我国建成世界最大人胚胎干细胞库中南大学生殖与干细胞工程研究所所长卢光琇带领科研团队，建成了目中南大学生殖与干细胞工程研究所所长卢光琇带领科研团队，建成了目中南大学生殖与干细胞工程研究所所长卢光琇带领科研团队，建成了目中南大学生殖与干细胞工程研究所所长卢光琇带领科研团队，建成了目前世界上最大的具有不同组织，相容性抗原的人胚胎干细胞库前世界上最大的具有不同组织，相容性抗原的人胚胎干细胞库前世界上最大的具有不同组织，相容性抗原的人胚胎干细胞库前世界上最大的具有不同组织，相容性抗原的人胚胎干细胞库建立的人胚胎干细胞系已达建立的人胚胎干细胞系已达建立的人胚胎干细胞系已达建立的人胚胎干细胞系已达300300多株，使保存的早期微量细胞的复苏效多株，使保存的早期微量细胞的复苏效多株，使保存的早期微量细胞的复苏效多株，使保存的早期微量细胞的复苏效率超过了率超过了率超过了率超过了95%95%，达到国际领先水平。

达到国际领先水平达到国际领先水平达到国际领先水平并建立了世界上首个基因完全纯合的人类孤雌干细胞系并建立了世界上首个基因完全纯合的人类孤雌干细胞系并建立了世界上首个基因完全纯合的人类孤雌干细胞系并建立了世界上首个基因完全纯合的人类孤雌干细胞系我国建成世界最大人胚胎干细胞库n n替换那些因病替换那些因病替换那些因病替换那些因病“ “下岗下岗下岗下岗” ”的细胞的细胞的细胞的细胞￿ ￿ ￿ ￿n n修复那些修复那些修复那些修复那些“ “过劳死过劳死过劳死过劳死” ”的组织的组织的组织的组织￿ ￿ ￿ ￿n n起到起到起到起到“ “全能修理工全能修理工全能修理工全能修理工” ”的作用的作用的作用的作用￿ ￿ ￿ ￿n n目前目前目前目前, , 除除除除造血干细胞移植造血干细胞移植造血干细胞移植造血干细胞移植被作为成熟技术应用于临床被作为成熟技术应用于临床被作为成熟技术应用于临床被作为成熟技术应用于临床治疗外，其他干细胞移植技术尚处在临床研究阶段治疗外，其他干细胞移植技术尚处在临床研究阶段治疗外，其他干细胞移植技术尚处在临床研究阶段治疗外，其他干细胞移植技术尚处在临床研究阶段￿ ￿ 干细胞移植干细胞移植造血干细胞作为干细胞研究造血干细胞作为干细胞研究与应用的突破口与应用的突破口n造血细胞是造血细胞是细胞增殖分化细胞增殖分化的最佳模型。

的最佳模型n￿ ￿造血干／祖细胞及各系血细胞的造血干／祖细胞及各系血细胞的表面标志表面标志较为清楚较为清楚￿ ￿，可进行定量分，可进行定量分析，且可分选析，且可分选n￿ ￿造血干细胞增殖及向各系分化的重要造血干细胞增殖及向各系分化的重要诱导因子、受体、信号转导、诱导因子、受体、信号转导、微环境微环境（（niche）等因素较为清楚等因素较为清楚n￿ ￿造血细胞发挥功能可相对造血细胞发挥功能可相对游离游离，不需，不需“生物支架生物支架”、神经、血管、、神经、血管、外科移植等复杂的外科移植等复杂的“下游下游”工艺，便于直接应用于临床工艺，便于直接应用于临床The Nobel Prize, 1990E. Donnall Thomas first succsessful HSCT in treatment of acute leukemiaThomas ED, Lochte HL, Lu WC, Ferrebee JW. Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy. N. Engl. J. Med. 1957; 257: 491.什么是造血干细胞移植？什么是造血干细胞移植？ ( (Heamatopoietic Stem Cell Transplantation，，HSCT) 经大剂量放化疗或其他经大剂量放化疗或其他免疫抑制预处理，清除受体免疫抑制预处理，清除受体体内的肿瘤细胞和异常克隆体内的肿瘤细胞和异常克隆细胞，阻断发病机制，然后细胞，阻断发病机制，然后把自体或异体造血干细胞移把自体或异体造血干细胞移植给受体，使受体重建正常植给受体，使受体重建正常造血和免疫功能，从而达到造血和免疫功能，从而达到治疗目的的一种治疗手段。

治疗目的的一种治疗手段一、按一、按细胞细胞来源来源造血干细胞移植的分类造血干细胞移植的分类造血干细胞移植的分类造血干细胞移植的分类骨髓干细胞移植骨髓干细胞移植（（（（BMTBMTBMTBMT））））外周血造血干细胞移植外周血造血干细胞移植(PBHSCT)(PBHSCT)(PBHSCT)(PBHSCT)脐带血干细胞移植（脐带血干细胞移植（UCBSCT)UCBSCT)UCBSCT)UCBSCT)胎肝移植胎肝移植 (FLCT)(FLCT)(FLCT)(FLCT)自体（自体（autologous））异体造血干细胞移植异体造血干细胞移植异种（异种（xenogeneie））二、按二、按供体与宿主供体与宿主的关系的关系同基因同基因 （（syngeneic）） : 同卵双生同卵双生异基因异基因 (allogeneic ））: 有血缘有血缘 （（related）） 无血缘无血缘（（un-related) 清髓性造血干细胞移植清髓性造血干细胞移植非清髓性造血干细胞移植非清髓性造血干细胞移植三、三、按按供受体间供受体间HLAHLA相关性相关性 (Human Leukocyte Antigen)(Human Leukocyte Antigen) HLAHLA全相合全相合HLAHLA不全相合不全相合HLAHLA不相合不相合四、四、CD34CD34＋＋细胞移植细胞移植五、按五、按预处理强度和目的预处理强度和目的1 1 骨髓移植骨髓移植（（bone marrow transplantationbone marrow transplantation，，BMTBMT）） 通过多点骨髓腔穿刺，抽吸含通过多点骨髓腔穿刺，抽吸含HSCHSC的骨髓血混合液，是的骨髓血混合液，是经典经典的移植方法，效果可靠。

但采髓需在的移植方法，效果可靠但采髓需在全麻或硬膜外麻醉全麻或硬膜外麻醉下进行，下进行，通常需采集骨髓混合液通常需采集骨髓混合液600-1000ml600-1000ml，具体数值随患者体重来定，具体数值随患者体重来定, ,但但GVHDGVHD (graft versus host disease)(graft versus host disease) 发生包括包括 自体自体BMT BMT （（autologous BMTautologous BMT，，ABMTABMT）） 同基因同基因BMTBMT（（syngeneic BMTsyngeneic BMT，，syn-BMTsyn-BMT）） 异基因异基因BMTBMT（（allogeneic BMTallogeneic BMT，，allo-BMTallo-BMT）） 2 2 外周血干细胞移植外周血干细胞移植(peripheral blood stem cell transplantation, (peripheral blood stem cell transplantation, PBSCT)PBSCT) 使用药物和细胞因子使用药物和细胞因子动员动员, ,促使促使HSCHSC从骨髓释放到外周从骨髓释放到外周血，然后通过血，然后通过血细胞分离机血细胞分离机从循环血中收集从循环血中收集HSCHSC。

与与BMTBMT相相比，具有比，具有采集方便采集方便、供者、供者不需麻醉不需麻醉、移植后造血细胞、移植后造血细胞恢复恢复快快，而，而GVHDGVHD发生率和严重程度并无明显增加等优点发生率和严重程度并无明显增加等优点包括包括 自体自体 PBSCTPBSCT（（autologous APBSCTautologous APBSCT）） 异体异体 PBSCT(allogeneic PBSCT, allo-PBSCT)PBSCT(allogeneic PBSCT, allo-PBSCT) 3 3 脐带血干细胞移植脐带血干细胞移植( (Umbilical cord bloodUmbilical cord blood stem cell transplantation，UCBSCT ) 胎儿脐带血和胎盘中含有大量造血干细胞，且胎儿脐带血和胎盘中含有大量造血干细胞，且免疫原性免疫原性不成熟，不成熟，在同胞兄妹中在同胞兄妹中HLAHLA配型不完全相合配型不完全相合者也能植活，不过无关供者脐血干细者也能植活，不过无关供者脐血干细胞移植仍需要作胞移植仍需要作HLAHLA配型。

与配型与BMTBMT及及PBSCTPBSCT相比，脐带血干细胞具有异体相比，脐带血干细胞具有异体排斥反应小，免疫原性低，排斥反应小，免疫原性低，再生能力和速度是前者的再生能力和速度是前者的 10 10 到到 20 20 倍倍，，受受病毒病毒感染的风险低等感染的风险低等特点 胎儿的脐带结构示意图胎儿的脐带结构示意图 脐带血干细胞体外集落图脐带血干细胞体外集落图 什么是造血干细胞？什么是造血干细胞？ Heamatopoietic Stem Cell，，HSC 红红色为色为CD34表型的造血干细胞，表型的造血干细胞，绿绿色为色为CD31表型的内皮细胞，表型的内皮细胞，蓝蓝色为色为DAPI胎盘绒毛膜显微镜图像胎盘绒毛膜显微镜图像祖祖祖祖/ / / /定向干定向干定向干定向干C C C C幼稚幼稚幼稚幼稚C(C(C(C(早中晚早中晚早中晚早中晚) ) ) )原始原始原始原始C C C C成熟成熟成熟成熟C C C C自我复制、多向分化自我复制、多向分化自我复制、多向分化自我复制、多向分化血细胞发生血细胞发生演变规律演变规律演变规律演变规律分化分化分化分化: : : : 强强强强 弱弱弱弱 无无无无胞体胞体胞体胞体: : : : 大大大大 小小小小胞核胞核胞核胞核: : : : 大大大大 小，染色质稀小，染色质稀小，染色质稀小，染色质稀 密，核仁有密，核仁有密，核仁有密，核仁有 无无无无胞质胞质胞质胞质: : : : 少少少少 多，嗜碱性由强多，嗜碱性由强多，嗜碱性由强多，嗜碱性由强 弱弱弱弱 无，特殊产物无无，特殊产物无无，特殊产物无无，特殊产物无 少少少少 多多多多HSC, haematopoietic stem cell; CLP, common lymphoid progenitor; CMP, common myeloid progenitor. Schematic view of adult haematopoiesis 存在于造血组织中的一类原始的造血细胞存在于造血组织中的一类原始的造血细胞 自我更新自我更新( (self renewself renewing)ing) 多向分化多向分化(multipotent differentiation )(multipotent differentiation ) 各种血细胞与免疫细胞的起源细胞。

各种血细胞与免疫细胞的起源细胞 能重建造血，同时重建免疫能重建造血，同时重建免疫造血干细胞（造血干细胞（HSC））第一节第一节 造血干造血干/ /祖细胞的生物学特性祖细胞的生物学特性外周血造血干外周血造血干/ /祖细胞物理特性祖细胞物理特性 正常外周血中正常外周血中正常外周血中正常外周血中HSCHSCHSCHSC含量极含量极含量极含量极少少少少，约为骨髓的，约为骨髓的，约为骨髓的，约为骨髓的1%,1%,1%,1%, 比中比中比中比中等大小圆型淋巴样单核细胞略等大小圆型淋巴样单核细胞略等大小圆型淋巴样单核细胞略等大小圆型淋巴样单核细胞略小小小小在人类尚无检测真正造血干细胞的方法，一般在人类尚无检测真正造血干细胞的方法，一般在人类尚无检测真正造血干细胞的方法，一般在人类尚无检测真正造血干细胞的方法，一般LTC-ICLTC-ICLTC-ICLTC-IC或或或或CFU-BICFU-BICFU-BICFU-BI可代表干细胞的数量可代表干细胞的数量可代表干细胞的数量可代表干细胞的数量CFU-GEMMCFU-GEMMCFU-GEMMCFU-GEMM代表多能造血祖细胞代表多能造血祖细胞代表多能造血祖细胞。

代表多能造血祖细胞外周血造血外周血造血外周血造血外周血造血/ / / /祖细胞约占单个核细胞的祖细胞约占单个核细胞的祖细胞约占单个核细胞的祖细胞约占单个核细胞的0.01-0.1%0.01-0.1%0.01-0.1%0.01-0.1%CFUCFU: colony forming unit : colony forming unit 集落形成单位集落形成单位LTC-ICLTC-IC: long-term culture initiating cell : long-term culture initiating cell 长期培养起始细胞长期培养起始细胞CFU-BICFU-BI: colony-forming unit-blast : colony-forming unit-blast 原始集落形成单位原始集落形成单位原始集落形成单位原始集落形成单位CFU-GEMMCFU-GEMM：：CFU-granulocyte/erythroid/ macrophage/megakaryocyteCFU-granulocyte/erythroid/ macrophage/megakaryocyte 粒粒/ /红红/ /巨噬巨噬/ /巨核集落形成单位巨核集落形成单位 CD34CD34+ + ( (最广泛的最广泛的HSCHSC的表面标志的表面标志) )AC133AC133＋＋ （细胞表面糖蛋白）（细胞表面糖蛋白） c-kit(CD117c-kit(CD117））+ +（（SCFR,SCFR,造血干细胞因子受体）造血干细胞因子受体）Flt3(CD135Flt3(CD135））+ +KDR + （（Vascular endothelial growth factor reecptor 2，，VEGFR2) CD38CD38－－CD33CD33- -Thy-1Thy-1- - （（CD90CD90lowlow）（胸腺细胞表面抗原标志））（胸腺细胞表面抗原标志）CD71CD71－－ HLAHLA- -DRDR－－（与细胞增殖有关）（与细胞增殖有关）MCD45RAMCD45RAlowlowLinLin－－ ( (已分化为特定细胞的标记已分化为特定细胞的标记) )Rh123Rh123lowlowHO33342HO33342lowlow外周血造血干外周血造血干/ /祖细胞祖细胞表型特性表型特性 方法：利用各种抗方法：利用各种抗方法：利用各种抗方法：利用各种抗CDCDCDCD抗抗抗抗原的单克隆抗体区分。

原的单克隆抗体区分原的单克隆抗体区分原的单克隆抗体区分外周血造血干外周血造血干/ /祖细胞功能特性祖细胞功能特性n n以体外半固体培养中集落形成能力来测定以体外半固体培养中集落形成能力来测定以体外半固体培养中集落形成能力来测定以体外半固体培养中集落形成能力来测定￿ ￿HSCLTC—ICHPP-CFCCFU-MBFU-ECFU-Meg淋巴祖细胞淋巴祖细胞CFU-GMCFU-GCFU-MIXCFUCFU: colony forming unit : colony forming unit 集落形成单位集落形成单位LTC-ICLTC-IC: long-term culture initiating cell : long-term culture initiating cell 长期培养起始细胞长期培养起始细胞HPP-CFCHPP-CFC: high proliferation potential colony foming cell : high proliferation potential colony foming cell 高增殖力集落形成单位高增殖力集落形成单位CFU-MIXCFU-MIX: : 混合集落形成细胞混合集落形成细胞 CFU-GMCFU-GM: : 粒单细胞集落形成细胞粒单细胞集落形成细胞CFU-GCFU-G: : 粒细胞集落形成细胞粒细胞集落形成细胞 CFU-MCFU-M: : 巨噬细胞集落形成细胞巨噬细胞集落形成细胞CFU-ECFU-E: : 红细胞爆式集落形成细胞红细胞爆式集落形成细胞 CFU-MegCFU-Meg: : 巨核细胞系集落形成细胞巨核细胞系集落形成细胞早早早早期期期期祖祖祖祖细细细细胞胞胞胞多多多多向向向向或或或或双双双双向向向向定定定定向向向向集落形成的关键是培养体系（细胞因子和血清等）集落形成的关键是培养体系（细胞因子和血清等）集落形成的关键是培养体系（细胞因子和血清等）集落形成的关键是培养体系（细胞因子和血清等）CFU-GMCFU-GMCFU-GMCFU-GM和总和总和总和总CFCCFCCFCCFC常用作评估外周血移植物质量的指标常用作评估外周血移植物质量的指标常用作评估外周血移植物质量的指标常用作评估外周血移植物质量的指标骨髓象分析骨髓象分析遗传学、免疫学及分子生物学分析遗传学、免疫学及分子生物学分析配型配型采集采集HSC预处理：预处理：TBI(total body irradiation））回到层流病房回到层流病房 HSCHSC输注输注造血干细胞移殖流程造血干细胞移殖流程第二节第二节 造血干细胞的动员、采集、处理造血干细胞的动员、采集、处理造血功能恢复造血功能恢复动员动员采集采集冻存冻存预处理预处理回输回输一一. . 外周血造血干外周血造血干/ /祖细胞动员祖细胞动员n n动员的机制动员的机制动员的机制动员的机制 n n“ “造血动员式造血动员式造血动员式造血动员式” ”化疗化疗化疗化疗 n n化疗动员的具体方案化疗动员的具体方案化疗动员的具体方案化疗动员的具体方案n n造血因子的使用造血因子的使用造血因子的使用造血因子的使用n n化疗与造血因子联合化疗与造血因子联合化疗与造血因子联合化疗与造血因子联合 动员剂将造血干细胞动员到外周血。

动员剂将造血干细胞动员到外周血 化疗药物化疗药物: :反馈性反馈性造血增生造血增生 造血细胞因子造血细胞因子: :刺激造血细胞增殖及向髓外刺激造血细胞增殖及向髓外转移转移 动员前动员前: PB CD34: PB CD34+ + 0.1-0.2% 0.1-0.2%，， 动员后：动员后： 1-2%1-2%（一）动员的（一）动员的机制机制 具体方案具体方案n n大剂量单一化疗药物大剂量单一化疗药物大剂量单一化疗药物大剂量单一化疗药物：：：： CTX (cytoxan,CTX (cytoxan,CTX (cytoxan,CTX (cytoxan,环磷酰胺环磷酰胺环磷酰胺环磷酰胺)- )- )- )- 4g-7g/m4g-7g/m4g-7g/m4g-7g/m2 2 2 2 VP16 (etoposide VP16 (etoposide VP16 (etoposide VP16 (etoposide，依托泊苷，依托泊苷，依托泊苷，依托泊苷)- 2g/m)- 2g/m)- 2g/m)- 2g/m2 2 2 2 Melphalan Melphalan （马法兰）（马法兰）- 140mg/(m- 140mg/(m2, 2, d1-2)d1-2)n n联合化疗联合化疗联合化疗联合化疗 CTX 4g/mCTX 4g/mCTX 4g/mCTX 4g/m2 2 2 2, , , , VP16 600mg/mVP16 600mg/mVP16 600mg/mVP16 600mg/m2 2 2 2 （二）（二）“造血动员式造血动员式”化疗化疗（三）造血因子的使用三）造血因子的使用GM-CSFGM-CSF：：Granulocyte-macrophage Granulocyte-macrophage colony stimulating factorcolony stimulating factor 粒粒——巨噬巨噬细胞集落刺激因子细胞集落刺激因子 G-CSFG-CSF：：Granulocyte colony-Granulocyte colony-stimulating factorstimulating factor粒粒—巨噬细胞集落巨噬细胞集落刺激因子刺激因子SCFSCF：：stem cell factor stem cell factor 干细胞因子干细胞因子IL-3IL-3：：interlukin-3 interlukin-3 白介素白介素-3-3IL-11IL-11：： interlukin-11 interlukin-11 白介素白介素-11-11IL-8IL-8：：interlukin-8 interlukin-8 白介素白介素-8-8IL-1IL-1：： interlukin-8 interlukin-8 白介素白介素-1-1MIP-1MIP-1：：Macrophage Inflammatory Macrophage Inflammatory Proteins Proteins 巨噬细胞炎症蛋白巨噬细胞炎症蛋白1 1 PIXY321PIXY321：：重组人重组人GM-CSF/IL-3GM-CSF/IL-3融合蛋白融合蛋白（（四）化疗与造血因子联合四）化疗与造血因子联合化疗及化疗及化疗及化疗及G-CSFG-CSFG-CSFG-CSF的联合动员的联合动员的联合动员的联合动员化疗及化疗及化疗及化疗及GM-CSFGM-CSFGM-CSFGM-CSF的联合动员的联合动员的联合动员的联合动员化疗及其他细胞因子的联合动员化疗及其他细胞因子的联合动员化疗及其他细胞因子的联合动员化疗及其他细胞因子的联合动员 IL-3 PIXY321 SCFIL-3 PIXY321 SCFIL-3 PIXY321 SCFIL-3 PIXY321 SCF二二 外周血造血干外周血造血干/ /祖细胞采集祖细胞采集（一）（一）供者准备供者准备患者用化疗患者用化疗患者用化疗患者用化疗药物药物药物药物及及及及造血细胞因子造血细胞因子造血细胞因子造血细胞因子联合动员联合动员联合动员联合动员在白细胞数从最低点回升达到在白细胞数从最低点回升达到在白细胞数从最低点回升达到在白细胞数从最低点回升达到1X101X101X101X109 9 9 9/L/L/L/L时开始采集，有时时开始采集，有时时开始采集，有时时开始采集，有时延误到延误到延误到延误到4X104X104X104X109 9 9 9/L/L/L/L。

常规使用常规使用常规使用常规使用ACD-AACD-AACD-AACD-A（（（（acid citrate dexotrose solution acid citrate dexotrose solution acid citrate dexotrose solution acid citrate dexotrose solution A,A,A,A,酸性枸橼酸盐葡萄糖溶液）抗凝酸性枸橼酸盐葡萄糖溶液）抗凝酸性枸橼酸盐葡萄糖溶液）抗凝酸性枸橼酸盐葡萄糖溶液）抗凝血细胞分离机血细胞分离机：全自动、全封闭、：全自动、全封闭、连续和不连续、间歇的血细胞分离连续和不连续、间歇的血细胞分离机如CS3000plusCS3000plus每天一次，每次每天一次，每次10L10L全血，可连续全血，可连续2-32-3次次( (二二) )采集冷冻保存：采集冷冻保存：分离外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞1 1 采集的细胞数采集的细胞数评价移植物评价移植物评价移植物评价移植物是否足够是否足够是否足够是否足够 有核细胞总数：有核细胞总数：2-6 X 102-6 X 108 8/kg/kg CFU CFU检测检测 CD34CD34+ + 细胞数：细胞数：1-3 X 101-3 X 106 6/kg/kg ACD-AACD-A：大量使用时致：大量使用时致ACDACD中毒引起低钙中毒引起低钙—少量。

少量 容量不足：通过打断采集程序即不断减少流速来完成容量不足：通过打断采集程序即不断减少流速来完成 血小板减少症（血小板减少症（thrombocytopeniathrombocytopenia）：由于血小板（）：由于血小板（plateletplatelet））粘附于设备表面引起的，通过回输富含血小板的血浆粘附于设备表面引起的，通过回输富含血小板的血浆(platelet rich (platelet rich plasma, PRP)plasma, PRP)或输血小板来纠正或输血小板来纠正2 2 采集并发症采集并发症3 3 处理处理 细胞浓度：细胞浓度：5 X105 X107 7/ml pH>7 4℃/ml pH>7 4℃保存保存 CFUCFU最好 4 4 进一步处理进一步处理 富集富集CD34CD34+ +, , 去除肿瘤细胞，去除去除肿瘤细胞，去除T T细胞细胞5 5 冷冻保存冷冻保存 常温液态下储存几天，通常冷冻常温液态下储存几天，通常冷冻常温液态下储存几天，通常冷冻常温液态下储存几天，通常冷冻 加入细胞保护剂加入细胞保护剂加入细胞保护剂加入细胞保护剂DMSODMSODMSODMSO。

 6 6 长期储存长期储存 在在在在-196-196℃℃℃℃液氮中至少液氮中至少液氮中至少液氮中至少5 5 5 5年 在在在在-80℃-80℃-80℃-80℃机械冰箱储存的时间最长为机械冰箱储存的时间最长为机械冰箱储存的时间最长为机械冰箱储存的时间最长为2.52.52.52.5年 应装置应装置应装置应装置24242424小时警备系统小时警备系统小时警备系统小时警备系统 避免交叉感染的因素避免交叉感染的因素避免交叉感染的因素避免交叉感染的因素 如袋子之间用双腔袋、冷存时液态蒸发等如袋子之间用双腔袋、冷存时液态蒸发等如袋子之间用双腔袋、冷存时液态蒸发等如袋子之间用双腔袋、冷存时液态蒸发等 四 解冻与回输 副反应：副反应：DMSODMSO诱导组胺释放诱导组胺释放 措施：患者要经过水化和用抗组胺药抗休措施：患者要经过水化和用抗组胺药抗休克 目的：减少血管塌陷和低血压目的：减少血管塌陷和低血压第三节第三节 CD34CD34+ +细胞的分选细胞的分选一一 CD34CD34+ +细胞的分选的必要性细胞的分选的必要性 在体外纯化和在体外纯化和在体外纯化和在体外纯化和富集富集富集富集CD34CD34CD34CD34+ + + +细胞。

细胞在在在在APBSCTAPBSCTAPBSCTAPBSCT中，中，中，中，净化净化净化净化残留肿瘤细胞而减少复发残留肿瘤细胞而减少复发残留肿瘤细胞而减少复发残留肿瘤细胞而减少复发在在在在allo-PBSCTallo-PBSCTallo-PBSCTallo-PBSCT中中中中, , , ,去去去去除除除除T T T T细胞细胞细胞细胞, , , , 减轻减轻减轻减轻GVHDGVHDGVHDGVHD发生对难治性自身免疫性疾病，可纯化对难治性自身免疫性疾病，可纯化对难治性自身免疫性疾病，可纯化对难治性自身免疫性疾病，可纯化除去异常除去异常除去异常除去异常免疫细胞免疫细胞免疫细胞免疫细胞可可可可提高提高提高提高干细胞体外干细胞体外干细胞体外干细胞体外扩增扩增扩增扩增及及及及基因转导基因转导基因转导基因转导的效率 二二 造血干细胞移植物中肿瘤细胞的污染造血干细胞移植物中肿瘤细胞的污染n n基因标记实验证实了一些肿瘤病人，自体移植后绝大数患基因标记实验证实了一些肿瘤病人，自体移植后绝大数患基因标记实验证实了一些肿瘤病人，自体移植后绝大数患基因标记实验证实了一些肿瘤病人，自体移植后绝大数患者检出基因标记的肿瘤细胞。

者检出基因标记的肿瘤细胞者检出基因标记的肿瘤细胞者检出基因标记的肿瘤细胞n n用药物体外净化比未净化的移植复发率低用药物体外净化比未净化的移植复发率低用药物体外净化比未净化的移植复发率低用药物体外净化比未净化的移植复发率低n n残留肿瘤细胞再输入是肿瘤复发的重要因素残留肿瘤细胞再输入是肿瘤复发的重要因素残留肿瘤细胞再输入是肿瘤复发的重要因素残留肿瘤细胞再输入是肿瘤复发的重要因素n n因此，从自体移植物中清除污染的肿瘤细胞是十分必要的因此，从自体移植物中清除污染的肿瘤细胞是十分必要的因此，从自体移植物中清除污染的肿瘤细胞是十分必要的因此，从自体移植物中清除污染的肿瘤细胞是十分必要的 低倍镜下肿瘤细胞低倍镜下肿瘤细胞低倍镜下肿瘤细胞低倍镜下肿瘤细胞 免疫净化（免疫净化（ immunologic purgingimmunologic purging））n n定义：在体外用免疫学的方法消除移植物中残留的肿瘤细定义：在体外用免疫学的方法消除移植物中残留的肿瘤细定义：在体外用免疫学的方法消除移植物中残留的肿瘤细定义：在体外用免疫学的方法消除移植物中残留的肿瘤细胞的措施胞的措施胞的措施胞的措施。

n n免疫免疫免疫免疫正净化正净化正净化正净化（（（（immunologic positive purgingimmunologic positive purgingimmunologic positive purgingimmunologic positive purging）：将正常）：将正常）：将正常）：将正常造血干细胞从移植物中纯化出来造血干细胞从移植物中纯化出来造血干细胞从移植物中纯化出来造血干细胞从移植物中纯化出来n n免疫免疫免疫免疫负净化负净化负净化负净化(immunologic negative purging)(immunologic negative purging)(immunologic negative purging)(immunologic negative purging)：将肿瘤细：将肿瘤细：将肿瘤细：将肿瘤细胞从自体移植物中清除胞从自体移植物中清除胞从自体移植物中清除胞从自体移植物中清除n n免疫免疫免疫免疫双净化双净化双净化双净化（（（（ immunologic double purgingimmunologic double purgingimmunologic double purgingimmunologic double purging）将免疫正、）将免疫正、）将免疫正、）将免疫正、负净化法结合起来。

负净化法结合起来负净化法结合起来负净化法结合起来CD34CD34+ +细胞正净化的优点细胞正净化的优点 避免细胞毒性药物和免疫毒素对正常避免细胞毒性药物和免疫毒素对正常避免细胞毒性药物和免疫毒素对正常避免细胞毒性药物和免疫毒素对正常HSCHSCHSCHSC的损伤；的损伤；的损伤；的损伤；无需抗肿瘤抗体净化的多环节体外处理，减少污染机会；无需抗肿瘤抗体净化的多环节体外处理，减少污染机会；无需抗肿瘤抗体净化的多环节体外处理，减少污染机会；无需抗肿瘤抗体净化的多环节体外处理，减少污染机会；不会因肿瘤细胞对细胞毒性药物和免疫毒素的敏感性不同不会因肿瘤细胞对细胞毒性药物和免疫毒素的敏感性不同不会因肿瘤细胞对细胞毒性药物和免疫毒素的敏感性不同不会因肿瘤细胞对细胞毒性药物和免疫毒素的敏感性不同而影响净化效应；而影响净化效应；而影响净化效应；而影响净化效应；如联合其它净化方法，可进一步提高净化效应如联合其它净化方法，可进一步提高净化效应如联合其它净化方法，可进一步提高净化效应如联合其它净化方法，可进一步提高净化效应; ; ; ;可减少冷冻保护剂可减少冷冻保护剂可减少冷冻保护剂可减少冷冻保护剂DMSODMSODMSODMSO的使用量，减少其副作用。

的使用量，减少其副作用的使用量，减少其副作用的使用量，减少其副作用三三 CD34CD34+ +细胞的分选的原理及方法细胞的分选的原理及方法 原理：原理：CD34CD34+ +细胞包含在单个核细胞组分中，在分选细胞包含在单个核细胞组分中，在分选CD34+CD34+细胞前，常用一些非免疫学（如物理或功能）方法去除移植物细胞前，常用一些非免疫学（如物理或功能）方法去除移植物中的红细胞和成熟粒细胞等成分中的红细胞和成熟粒细胞等成分 密度梯度离心法密度梯度离心法：它可获得富含单个核细胞的白细胞层，从：它可获得富含单个核细胞的白细胞层，从而初步富集了而初步富集了CD34CD34+ +细胞 临床上采用临床上采用血细胞分离机血细胞分离机：：按一定程序分离出经造血生长因按一定程序分离出经造血生长因子动员的外周血单个核细胞，这样大大减少了移植物体积，为子动员的外周血单个核细胞，这样大大减少了移植物体积，为进一步用免疫学分选进一步用免疫学分选CD34CD34+ +细胞做好准备细胞做好准备n ρρp p > > ρρm m，，S S > 0 > 0，颗粒顺着离心方向沉降，颗粒顺着离心方向沉降n ρρp p = = ρρm m，，S S = 0 = 0，颗粒达到某一位置后达到平衡，颗粒达到某一位置后达到平衡n ρρp p < < ρρm m，， S S < 0 < 0，颗粒逆着离心方向上浮，颗粒逆着离心方向上浮 离心后形成不同大小不同形状、具有一定沉离心后形成不同大小不同形状、具有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成若干降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成若干条界面清楚的不连续区带。

条界面清楚的不连续区带密度梯度离心密度梯度离心密度梯度离心密度梯度离心Ficoll Ficoll 密速梯度离心法分离外周血单个核细胞（密速梯度离心法分离外周血单个核细胞（密速梯度离心法分离外周血单个核细胞（密速梯度离心法分离外周血单个核细胞（PMBCPMBC））））￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿ 原理原理：利用密度梯度介质：利用密度梯度介质-聚蔗糖聚蔗糖-泛影葡泛影葡胺（淋巴细胞分离液），相对密度胺（淋巴细胞分离液），相对密度 1.077±0.001红细胞、粒细胞密度大，离红细胞、粒细胞密度大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中在分层液中SystemixSystemix公司：高速荧光激活细胞分选系公司：高速荧光激活细胞分选系统（统（high speed fluoresence-activated high speed fluoresence-activated cell sorting systemcell sorting system），它先用一系列），它先用一系列方法去除细胞各系标志阳性的定向祖细胞，方法去除细胞各系标志阳性的定向祖细胞，然后用流式细胞仪高速分选。

然后用流式细胞仪高速分选 流式细胞仪分离法（流式细胞仪分离法（Flow Cytometry, FCMFlow Cytometry, FCM））- -根据细胞表面抗原标志CD34CD34CD34CD34+ + + +CD34CD34CD34CD34+ + + + 将预分选的造血细胞与生物素化将预分选的造血细胞与生物素化（（biotinylatedbiotinylated）的抗）的抗CD34CD34的单克隆抗体一起孵育，的单克隆抗体一起孵育，然后洗去未结合的抗体，将样本通过抗生物素蛋白包然后洗去未结合的抗体，将样本通过抗生物素蛋白包被的聚丙烯酸胺柱的亲和素柱，被的聚丙烯酸胺柱的亲和素柱，CD34CD34+ +细胞滞留在柱细胞滞留在柱内的聚丙烯酸胺球表面上，通过轻轻的机械摇动，冲内的聚丙烯酸胺球表面上，通过轻轻的机械摇动，冲洗出洗出CD34CD34+ +细胞 CellproCellpro公司：公司：Ceprate Ceprate 临床型临床型CD34+CD34+细胞分选机细胞分选机免疫吸附法（免疫吸附法（Immunity AbsorptionImmunity Absorption，，IAIA）） —— 根据生物素抗亲和素柱分选系统根据生物素抗亲和素柱分选系统Anti-CD34Anti-CD34Anti-CD34Anti-CD34+ + + +biotinylated Abbiotinylated Abbiotinylated Abbiotinylated Ab Wash unbound Abs Wash unbound Abs Wash unbound Abs Wash unbound Abs Anti-biotiny Anti-biotiny Anti-biotiny Anti-biotiny affinity column affinity column affinity column affinity column Gentle shakingGentle shakingGentle shakingGentle shakingu 原理：已包被一抗的磁珠与细胞表原理：已包被一抗的磁珠与细胞表面相应分子特异性结合，或已包被二抗面相应分子特异性结合，或已包被二抗的磁珠与预先已与细胞表面分子特异结的磁珠与预先已与细胞表面分子特异结合的一抗结合。

磁珠携带与之结合的细合的一抗结合磁珠携带与之结合的细胞吸附于分离柱胞吸附于分离柱/ /试管上，实现阳性细试管上，实现阳性细胞分离或阴性细胞的分离胞分离或阴性细胞的分离 免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法（（magnetic activated cell sorting,magnetic activated cell sorting,MACSMACS ））四四 CliniMACSCliniMACS临床细胞分选系统临床细胞分选系统五五 自体外周血自体外周血CD34CD34+ +细胞移植的临床应用细胞移植的临床应用具有移植后造血和免疫功能恢复快等的特点具有移植后造血和免疫功能恢复快等的特点具有移植后造血和免疫功能恢复快等的特点具有移植后造血和免疫功能恢复快等的特点有净化污染肿瘤细胞效应高的优点有净化污染肿瘤细胞效应高的优点有净化污染肿瘤细胞效应高的优点有净化污染肿瘤细胞效应高的优点在治疗不表达在治疗不表达在治疗不表达在治疗不表达CD34CD34CD34CD34抗原的恶性肿瘤临床上广泛应用抗原的恶性肿瘤临床上广泛应用抗原的恶性肿瘤临床上广泛应用抗原的恶性肿瘤临床上广泛应用 包括：包括：包括：包括： 非何杰金氏淋巴瘤非何杰金氏淋巴瘤非何杰金氏淋巴瘤非何杰金氏淋巴瘤 （（NHLNHL）） 多发性骨髓瘤多发性骨髓瘤多发性骨髓瘤多发性骨髓瘤 乳腺癌乳腺癌乳腺癌乳腺癌 神经母细胞瘤神经母细胞瘤神经母细胞瘤神经母细胞瘤 其它疾病其它疾病其它疾病其它疾病, , , ,如自身免疫性疾病如自身免疫性疾病如自身免疫性疾病如自身免疫性疾病 HSCTHSCT已成为治疗及治愈如下疾病的最佳选择已成为治疗及治愈如下疾病的最佳选择恶性血液病恶性血液病急性髓细胞性白血病急性髓细胞性白血病 急性淋巴细胞白血病急性淋巴细胞白血病 慢性粒细胞性白血病慢性粒细胞性白血病 毛细胞性白血病毛细胞性白血病恶性组织细胞病恶性组织细胞病重型再生障碍性贫血重型再生障碍性贫血重型海洋性贫血重型海洋性贫血骨髓纤维化骨髓纤维化 恶性肿瘤恶性肿瘤骨髓增生异常综合症骨髓增生异常综合症 多多发性骨髓瘤发性骨髓瘤非霍奇金淋巴瘤非霍奇金淋巴瘤霍奇金淋巴瘤霍奇金淋巴瘤恶性疾病恶性疾病非恶性疾病非恶性疾病造血系统疾病造血系统疾病遗传性疾病遗传性疾病先天性免疫缺陷病先天性免疫缺陷病 先天性造血异常症先天性造血异常症 先天性骨骼异常症先天性骨骼异常症 粘多糖储蓄症粘多糖储蓄症 粘蛋白脂质代谢病粘蛋白脂质代谢病系统性红斑狼疮系统性红斑狼疮 多发性硬化症多发性硬化症糖尿病糖尿病 放射病放射病 AIDSAIDS病病自身免疫性疾病自身免疫性疾病干细胞治疗Ⅰ型型糖尿病 采用自体干细胞移植＋采用自体干细胞移植＋T T淋巴淋巴系统抑制的方法，可以重建免疫系统抑制的方法，可以重建免疫系统和胰腺功能系统和胰腺功能 根据国外根据国外5 5年长期随访跟踪结年长期随访跟踪结果显示，接受移植后的果显示，接受移植后的I I型糖尿病型糖尿病病人有病人有9090％以上停用或减少了胰％以上停用或减少了胰岛素注射。

岛素注射六六 异基因外周血异基因外周血CD34CD34+ +细胞移植的临床应用细胞移植的临床应用 HLAHLAHLAHLA相合相合相合相合的同胞间，减少或减轻的同胞间，减少或减轻的同胞间，减少或减轻的同胞间，减少或减轻GVHDGVHDGVHDGVHD；；；；HLAHLAHLAHLA不全相合不全相合不全相合不全相合（（（（1-31-31-31-3个位点不合），不仅减轻个位点不合），不仅减轻个位点不合），不仅减轻个位点不合），不仅减轻GVHDGVHDGVHDGVHD，且可增加移植，且可增加移植，且可增加移植，且可增加移植细胞量，减少移植物排斥反应；细胞量，减少移植物排斥反应；细胞量，减少移植物排斥反应；细胞量，减少移植物排斥反应；从从从从同一家族供体同一家族供体同一家族供体同一家族供体中输注中输注中输注中输注CD34+CD34+CD34+CD34+细胞，增强骨髓增生低下受体的造细胞，增强骨髓增生低下受体的造细胞，增强骨髓增生低下受体的造细胞，增强骨髓增生低下受体的造血功能；血功能；血功能；血功能；适用于适用于适用于适用于HLAHLAHLAHLA相合无关相合无关相合无关相合无关供受体间的移植；供受体间的移植；供受体间的移植；供受体间的移植；用于将供体用于将供体用于将供体用于将供体CD34CD34CD34CD34+ + + +细胞和细胞和细胞和细胞和T T T T淋巴细胞分离后淋巴细胞分离后淋巴细胞分离后淋巴细胞分离后分别先后分别先后分别先后分别先后移植和输注；移植和输注；移植和输注；移植和输注；适用于分选适用于分选适用于分选适用于分选CD34CD34CD34CD34+ + + +细胞后细胞后细胞后细胞后体外扩增体外扩增体外扩增体外扩增后的移植和输注；后的移植和输注；后的移植和输注；后的移植和输注；用于体外产生和扩增用于体外产生和扩增用于体外产生和扩增用于体外产生和扩增抗原特异性免疫效应细胞抗原特异性免疫效应细胞抗原特异性免疫效应细胞抗原特异性免疫效应细胞(antigen (antigen (antigen (antigen specific effector cell)specific effector cell)specific effector cell)specific effector cell)和和和和抗原递呈细胞（抗原递呈细胞（抗原递呈细胞（抗原递呈细胞（antigen antigen antigen antigen presenting cell, APCpresenting cell, APCpresenting cell, APCpresenting cell, APC），以进行细胞治疗。

以进行细胞治疗以进行细胞治疗以进行细胞治疗中国中国HSCTHSCT概况概况CSBMT (Chinese Society of BMT)中国不同城市的HSCT数量北京北京52%52%上海上海13%13%广东广东8%8%重庆重庆6%6%湖北湖北6%6%天津天津6%6%浙江浙江5%5%江苏江苏4%4%中国不同单位的HSCT数量中国HSCT适应症（2009）MMOther leukemiaAutoimmune diseaseSolid tumorAAAMLAMLAMLAML：：：： acute myelogenous leukemiaacute myelogenous leukemiaacute myelogenous leukemiaacute myelogenous leukemia急性髓性白血病急性髓性白血病急性髓性白血病急性髓性白血病ALLALLALLALL：：：： acute lymphoblastic acute lymphoblastic acute lymphoblastic acute lymphoblastic leukemialeukemialeukemialeukemia急性淋巴细胞白血病急性淋巴细胞白血病急性淋巴细胞白血病急性淋巴细胞白血病 MMMMMMMM：：：： Multiple MyelomaMultiple MyelomaMultiple MyelomaMultiple Myeloma，，，，多发性骨髓瘤多发性骨髓瘤多发性骨髓瘤多发性骨髓瘤 AAAAAAAA：：：：Aplastic Anemia Aplastic Anemia Aplastic Anemia Aplastic Anemia 再生障碍性贫血再生障碍性贫血再生障碍性贫血再生障碍性贫血CMLCMLCMLCML：：：：Chronic myelogenous leukemiaChronic myelogenous leukemiaChronic myelogenous leukemiaChronic myelogenous leukemia慢性粒细胞白血病慢性粒细胞白血病慢性粒细胞白血病慢性粒细胞白血病MDSMDSMDSMDS：：：： Myelodysplastic SyndromeMyelodysplastic Syndrome骨髓增生异常综合征骨髓增生异常综合征中国HSCT类型（2009） IdenticalsiblingHaploUnrelatedAutosyngeneicIdentical sibling: Identical sibling: Identical sibling: Identical sibling: 相同同胞相同同胞相同同胞相同同胞Haplo:Haplo:Haplo:Haplo:单倍型单倍型单倍型单倍型GIAC PrincipleG: G-CSF mobilizationI : Immuno-suppression intensified and prolonged A: ATG (anti thymocyte globulin )C: Combined BM & PB专家呼吁HSCT纳入医保范围n n美国、新加坡、新西兰等很多国家以及我国的香港、台美国、新加坡、新西兰等很多国家以及我国的香港、台美国、新加坡、新西兰等很多国家以及我国的香港、台美国、新加坡、新西兰等很多国家以及我国的香港、台湾、北京、上海均将湾、北京、上海均将湾、北京、上海均将湾、北京、上海均将HSCTHSCTHSCTHSCT纳入了医保范围。

纳入了医保范围纳入了医保范围纳入了医保范围 n n我国每年新增白血病患者我国每年新增白血病患者我国每年新增白血病患者我国每年新增白血病患者4―54―54―54―5万人，加上历年累计的患万人，加上历年累计的患万人，加上历年累计的患万人，加上历年累计的患者，全国有近百万名白血病患者需要接受者，全国有近百万名白血病患者需要接受者，全国有近百万名白血病患者需要接受者，全国有近百万名白血病患者需要接受HSCTHSCTHSCTHSCT 七七 CD34CD34+ +细胞移植的前景细胞移植的前景可应用多次强化后的可应用多次强化后的可应用多次强化后的可应用多次强化后的支持支持支持支持治疗；治疗；治疗；治疗；减少减少减少减少外周血白细胞外周血白细胞外周血白细胞外周血白细胞分离分离分离分离次数；次数；次数；次数；造血重建造血重建造血重建造血重建的速度比未经培养扩增的的速度比未经培养扩增的的速度比未经培养扩增的的速度比未经培养扩增的CD34CD34CD34CD34+ + + +细胞移植细胞移植细胞移植细胞移植快快快快；；；；将有限的将有限的将有限的将有限的脐血脐血脐血脐血CD34CD34CD34CD34+ + + +扩增到成人临床所需移植的扩增到成人临床所需移植的扩增到成人临床所需移植的扩增到成人临床所需移植的足够足够足够足够剂量。

剂量 CD34 CD34+ +细胞的体外扩增细胞的体外扩增将CD34+细胞诱发成树突状细胞的免疫治疗将人类肿瘤抗原通过逆转录病毒转染给将人类肿瘤抗原通过逆转录病毒转染给将人类肿瘤抗原通过逆转录病毒转染给将人类肿瘤抗原通过逆转录病毒转染给CD34CD34CD34CD34+ + + +细胞，然后在体外培养体系细胞，然后在体外培养体系细胞，然后在体外培养体系细胞，然后在体外培养体系中加人细胞生长因子，将其分化诱导成中加人细胞生长因子，将其分化诱导成中加人细胞生长因子，将其分化诱导成中加人细胞生长因子，将其分化诱导成DCDCDCDC，这种转染的肿瘤抗原的，这种转染的肿瘤抗原的，这种转染的肿瘤抗原的，这种转染的肿瘤抗原的DCDCDCDC较未较未较未较未转染肿瘤抗原的转染肿瘤抗原的转染肿瘤抗原的转染肿瘤抗原的DCDCDCDC在体外具有更强的刺激在体外具有更强的刺激在体外具有更强的刺激在体外具有更强的刺激CD4CD4CD4CD4+ + + +T T T T淋巴细胞功能淋巴细胞功能淋巴细胞功能淋巴细胞功能 Haemopoietic Stem Cell Common Myeloid ProgenitorCirculatingMyeloid DCCD34+Stem CellCD34+ DCEx vivo GM-CSF + Flt-3 + TNF Tumor antigentransductionCD34CD34+ +细胞与基因治疗细胞与基因治疗 CD34CD34CD34CD34+ + + +细胞是最理想的基因治细胞是最理想的基因治细胞是最理想的基因治细胞是最理想的基因治疗靶细胞。

疗靶细胞疗靶细胞疗靶细胞可采自患者本人，体外易于处可采自患者本人，体外易于处可采自患者本人，体外易于处可采自患者本人，体外易于处理，能进行有效的培养和扩增理，能进行有效的培养和扩增理，能进行有效的培养和扩增理，能进行有效的培养和扩增能自我更新以便转导的治疗基能自我更新以便转导的治疗基能自我更新以便转导的治疗基能自我更新以便转导的治疗基因，在患者细胞内因，在患者细胞内因，在患者细胞内因，在患者细胞内终身存在终身存在终身存在终身存在HSCT思考题思考题1.1.1.1.什么是造血干细胞（什么是造血干细胞（什么是造血干细胞（什么是造血干细胞（HSCHSCHSCHSC）？简）？简）？简）？简述其主要特征及其表面标志述其主要特征及其表面标志述其主要特征及其表面标志述其主要特征及其表面标志2.2.2.2.什么是造血干细胞移植什么是造血干细胞移植什么是造血干细胞移植什么是造血干细胞移植（（（（HSCTHSCTHSCTHSCT）？简述其分类简述其分类简述其分类简述其分类3.3.3.3.什么是外周血干细胞移植什么是外周血干细胞移植什么是外周血干细胞移植什么是外周血干细胞移植（（（（PBHSCTPBHSCTPBHSCTPBHSCT）及其特点？）及其特点？）及其特点？）及其特点？4.4.4.4.简述在简述在简述在简述在HSCTHSCTHSCTHSCT中，中，中，中，CD34+CD34+CD34+CD34+细胞的分细胞的分细胞的分细胞的分选的必要性及其方法。

选的必要性及其方法选的必要性及其方法选的必要性及其方法。