L-天冬酰胺酶的生产工艺p讲义教材.ppt

生工本2009级4班刘培培20092513418L-天冬酰胺酶的生产工艺LOGO（一）天冬酰胺酶的化学组成和性质 天冬酰胺酶是酰胺基水解酶，是大肠杆菌菌体中提取分离的酶类药物，用于治疗白血病1922年Clementi发现豚鼠血清中存在天冬酰胺酶；1953年Kidd发现豚鼠血清中有抑癌作用的物质，其活性成分是蛋白质；1961年Broome确定了其有效成分是天冬酰胺酶，后来，Mashburn等报告指出从大肠杆菌中分离出天冬酰胺酶，具有同样抗癌活性 天冬酰胺酶呈白色粉末状，微有湿性，溶于水，不溶于丙酮 三氯甲烷 乙醚和甲醇，水溶液20储存7d，5储存14d均不减少酶的活力干品50 15min酶活力降低30，60 1h内失活，最适PH8.5，最适温度37 （二）国内天冬酰胺酶的发展历程 目前,国内临床上应用的L2ASP 主要来源于大肠杆菌,我国天津生化厂于1974 年开始生产E1coli天冬酰胺酶,但由于菌种产酶能力低,提取精制工艺落后,难以与国外产品竞争,再加之其他原因最后停产为了填补国内空白,1995 年,中国药科大学吴梧桐教授等率先进行了E1coli 天冬酰胺酶ansB基因的克隆和表达研究,并首次在国内成功构建了高效表达L2ASP 的基因工程菌pKA/ CPU210009 ,工程菌发酵单位比野生株高出100 倍。

随后又优化了基因工程菌的培养条件和发酵工艺,确定了重组L2ASP 的纯化路线,并对重组产品进行了鉴定结果表明,基因工程菌生产的产品质量与天然品从基因序列、蛋白质一级结构到蛋白质的物理化学性质等方面均一致,两者具有同质性 这些研究成果为我国工业化生产优质、低价的注射用E1coliL2ASP 开辟了新的道路 （四）工艺流程 大肠杆菌产生的L2ASP 包括L2ASP 和L2ASP ,其中L2ASP 存在于细胞质中,与底物L2天冬酰胺的亲和力很小(Km = 1 10 - 3 mol/ L) ,没有抗肿瘤活性;而L2ASP 则分泌在细胞周质中,与L2天冬酰胺有很高的亲和力( Km = 1 10 - 5 mol/ L) ,有抗癌活性3 现今,产生L2ASP 的菌种主要包括Escherichia coli 、Erwinia carotovara、Serralia marcescem、PseudomonasSp1、Wolinella succinogenes 等 主要采用的提纯方法包括硫酸铵分级沉淀、乙醇分级沉淀、离子交换层析法、超滤、水系二相胶束系统、分批式吸附和直行式解吸附法、渗透休克法以及亲和层析法等816 。

采用不同方法最终得到目标产物的酶活力范围为220520157 U/ mg ,总回收率为31 %86 %天冬酰胺酶工艺流程图 大肠杆菌 肉汤菌种 种子菌种 发酵液 菌体 提取液 上清液 沉淀 洗脱液 洗脱液 冻干 L-天冬酰胺酶菌种培养肉汤培养基37 48h玉米浆培养基37 4-8h种子培养发酵玉米浆培养基37 6-8h离心提取蔗糖抽提液PH7.5 30 分级沉淀（NH4)2SO455饱和度PH7.0分级沉淀（NH4)2SO490饱和度离子沉淀DEAE-纤维素(DE52)离子交换CM-纤维素(CM52)工艺过程及要点1 菌种培养采用大肠肠杆菌Escherichia coli A.S.1.357,培养基加牛肉汁100mL,蛋白胨胨1g,氯氯化钠钠0.5g,琼琼脂2-2.5g 37,在试试管中培养24h，茄形瓶培养8h，锥锥形瓶培养16h2 种子培养培养基用玉米浆浆30kg，加水至300kg，接种量1%-15%，37，通气搅搅拌培养4-8h.一、总总述3 发发酵罐培养取玉米浆浆100Kg，接种量8%，37，通气搅搅拌培养6-8h，离心分离发发酵液，得菌体加2倍量丙酮酮搅搅拌，压滤压滤 ，滤饼过筛滤饼过筛 ，自然风风干成菌体干粉。

4 蔗糖溶液抽提将菌体细细胞中加入5倍体积积的蔗糖溶液（蔗糖40%溶菌酶200mg/L,EDTA10mmol/L,PH7.5),30振荡荡2h,8000r/min离心，收取上层层酶液5 硫酸铵分级沉淀取上述酶液，加入（NH4)2SO4至55%饱和度，调PH至7.0，室温搅拌1h，离心除去沉淀，取上清液加入（NH4)2SO4到90%饱和度，离心收集沉淀6 纯化将沉淀用50mmol/L,PH7.0磷酸缓冲液溶解并透析，透析后的酶液，通过预先用10mmol/L，PH7.6磷酸缓冲液平衡的DEAE-纤维素层析柱（1cm30cm）,用30mmol/L磷酸缓冲液洗脱，流速为40mL/h,收集天冬酰胺酶活性组分，再调整PH4.8,通过预先用50mmol/L,PH4.9的磷酸缓冲液平衡的CM-纤维素层析柱（1cm8cm）,用50mmol/L,PH5.2的磷酸缓冲液洗脱，收集酶活性组分，冷冻干燥，即得L-天冬酰胺酶冻干粉，总收率为31%，比活为220U/mg蛋白二、工艺艺流程图图v （1）丝丝状菌三级级发发酵工艺艺流程冷冻冻管（25C，孢孢子培养，7天）斜面母瓶（25C，孢孢子培养，7天）大米孢孢子（26C，种子培养56h）一级级种子培养液（27C，种子培养，24h）二级级种子培养液（2726C,发发酵,7天）发发酵液。

2）球状菌二级级发发酵工艺艺流程冷冻冻管（25C，孢孢子培养，68天）亲亲米（25C，孢孢子培养，810天）生产产米（28C，孢孢子培养，5660h）种子培养液（2625-24C，发发酵，7天）发发酵液三、青霉素发发酵过过程v 青霉素发发酵时时，青霉素生产产菌在合适的培养基、PH、温度和通气搅搅拌等发发酵条件下进进行生长长并合成青霉素v 发发酵开始前，有关设备设备 和培养基（主要是碳源、氮源、前体和无机盐盐等）必须须先经过经过 灭灭菌，后接入种子v 在整个过过程中，需要不断通气和搅搅拌，维维持一定的罐温和罐压压，在发发酵过过程中往往要加入泡沫剂剂，假如酸碱控制发发酵液的PH，还还需要间间歇或连续连续 的加入葡萄糖及铵盐铵盐 等化合物以补补充碳源及氮源，或补进补进 其他料液和前体等以促进进青霉素的生产产青霉素发发酵过过程中的代谢变谢变 化分为为菌体生长长、青霉素合成和菌体自溶三个阶阶段v菌体生长阶长阶 段：发发酵培养基接种后生产产菌在合适的环环境中经过经过 短时间时间 的适应应，即开始发发育、生长长和繁殖，直至达到菌体的临临界浓浓度 v青霉素合成阶阶段：这这个阶阶段主要合成青霉素，青霉素的生产产速率达到最大，并一直维维持到青霉素合成能力衰退。

在这这个阶阶段，菌体重量有所增加，但产产生菌的呼吸强度一般无显显著变变化v菌体自溶阶阶段：这这个阶阶段菌体衰老，细细胞开始自溶，合成青霉素能力衰退，青霉素生产产速率下降，氨基氮增加，PH上升。