内蒙古天然牧草青贮氨态氮、有机酸含量的测定方法.pdf

DB15/XXXXXXXXX4附录A（规范性）氨态氮含量的测定方法A.1方法比色法A.2原理试样直接用水提取后，浸提液中 NH4+在强碱性介质与次氯酸盐和苯酚发生反应，生成水溶性染料靛酚蓝，其颜色深浅与溶液中 NH4+含量呈正比A.3试剂和材料A.3.1苯酚试剂将 0.05 g 亚硝基铁氰化钠溶解在 500 mL 蒸馏水中，再加入 11 mL 苯酚溶液或 9.0 g 结晶苯酚，混合均匀后定容到 1 000 mL，贮藏于棕色试剂瓶中，低温避光保存A.3.2次氯酸盐溶液将 5.0 g 氢氧化钠溶解在 700 mL 的蒸馏水中，再加入 20.1 g 磷酸氢二钠，中火加热并不断搅拌至完全溶解冷却加入 14.7 mL 含 8.5%活性氯的次氯酸钠溶液并混匀，定容到 1 000 mL，贮藏于棕色试剂瓶中，低温避光保存A.3.3标准铵溶液称取 0.6607 g 经 100条件下烘干 24 h 的（NH4）2SO4溶于水中，定容至 100 mL，配置成 0.1 mol/L的铵储备液将上述储备液稀释配置成 1.0 mmol/L、2.0 mmol/L、3.0 mmol/L、4.0 mmol/L、5.0 mmol/L五种不同浓度梯度的标准液。

A.4 仪器A.4.1 分光光度计：配 1 cm 石英比色皿A.4.2 天平：感量为 0.000 1 g 和 0.01 gA.5 分析步骤A.5.1标准曲线的制作取 6 个 50 mL 容量瓶，分别吸取铵储备液 0.5 m、1.0 m、1.5 m、2.0 m、2.5 mL 并定容配制成 1.0mmol/L、2.0 mmol/L、3.0 mmol/L、4.0 mmol/L、5.0 mmol/L 五种不同浓度梯度的标准工作液取 6 支试管，分别向每支试管中加入 50 L 标准工作液，空白为 50 L 蒸馏水；向每支试管中加入 2.5 mL 的DB15/XXXXXXXXX5苯酚试剂，摇匀；再向每支试管中加入 2mL 次氯酸钠试剂，混匀；将混合液在 95水浴中加热显色反应 5 min；冷却后，在 630 nm 波长下比色以吸光度与标准液浓度为坐标轴绘制标准曲线A.5.2试样溶液的测定向每支试管中加入 50 L 经适当倍数稀释的试样溶液，重复 2 次，空白为 50 L 蒸馏水按标准曲线的检测步骤测定试样溶液的吸光度以样品的吸光度与标准曲线比较求出含量A.6 结果计算试样中氨态氮含量按式（A.1）计算：X=C(V+mw）n18m1000（A.1）式中：X试样中氨态氮的含量，单位为克每千克（g/kg）；C由标准曲线求得试样溶液中氨态氮的浓度，单位为毫摩尔每升（mmol/L）；V制备青贮饲料浸提液时水的体积，单位为毫升（mL）；m制备青贮饲料浸提液所用青贮饲料质量，单位为克（g）；w青贮饲料中水的质量分数；n样品稀释倍数；1 000换算系数。

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算数平均值表示，结果保留两位有效数字DB15/XXXXXXXXX6附录B（规范性）有机酸含量的测定方法B.1方法高效液相色谱法B.2原理根据浸提液中离子交换体和离子溶质的静电相互作用（排斥）进行分离，以保留时间定性，外标法定量B.3材料和试剂所用试剂均为优级纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水B.3.1试剂B.3.1.1高氯酸溶液称取高氯酸 0.849 3 g，加水定容至 2 000 mL，混匀B.3.2标准品B.3.2.1 乳酸标准品（CH5CHCOOH），纯度99%B.3.2.2 乙酸标准品（CH5COOH），纯度99%B.3.2.3 丙酸标准品（CH5CH2COOH），纯度99%B.3.2.4 丁酸标准品（CH5CH2CH2COOH），纯度99%B.3.3标准溶液B.3.3.1 乳酸标准储备溶液（10 mg/mL）：称取按其纯度折算为 100%质量的乳酸 0.1 g（精确到 0.000 1 g），置于 10mL 容量瓶中，加超纯水至刻度，混匀，于 4保存B.3.3.2 乙酸标准储备溶液（10 mg/mL）：称取按其纯度折算为 100%质量的乙酸 0.1 g（精确到 0.000 1 g），置于 10 mL 容量瓶中，加超纯水至刻度，混匀，于 4保存。

B.3.3.3 丙酸标准储备溶液（5 mg/mL）：称取按其纯度折算为 100%质量的丙酸 0.05 g（精确到 0.000 1 g），置于 10 mL 容量瓶中，加超纯水至刻度，混匀，于 4保存DB15/XXXXXXXXX7B.3.3.4 丁酸标准储备溶液（5 mg/mL）：称取按其纯度折算为 100%质量的丁酸 0.05 g（精确到 0.000 1 g），置于 10 mL 容量瓶中，加超纯水至刻度，混匀，于 4保存B.3.3.5 乳酸、乙酸、丙酸、丁酸混合标准曲线工作液：分别吸取各单标储备溶液 0.25 mL、0.5 mL、1.0mL、1.5 mL、2.0 mL 和 2.5 mL 于 6 个 10 mL 容量瓶中，用超纯水定容至刻度，混匀，于 4保存B.3.4材料离子排阻色谱柱B.4仪器和设备B.4.1 高效液相色谱仪，带二极管阵列检测器或紫外检测器B.4.2 天平：感量为 0.000 1 g 和 0.01 gB.4.3 玻璃砂芯真空过滤装置B.4.4 水相型微孔滤膜：孔径0.45 mB.4.5 注射器B.4.6 水系针筒过滤器：孔径0.45 mB.4.7 超声波清洗器B.4.8 高速离心机。

B.5分析步骤B.5.1试样处理青贮饲料浸提液 12 000 r/min 离心 3 min，取上清液经水相滤膜过滤，注入高效液相色谱仪分析B.5.2仪器参考条件B.5.2.1 色谱柱：Shodex Rspark KC-811 柱，8 mm300 mm 或同等性能的色谱柱B.5.2.2 流动相：用 3 mmol 的高氯酸溶液，经水相滤膜过滤，脱气B.5.2.3 柱温：50B.5.2.4 进样量：5 LDB15/XXXXXXXXX8B.5.2.5 检测波长：210 nmB.5.2.6 流速：1 mL/minB.5.3标准曲线的制作将标准系列工作液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰高或峰面积以标准工作液的浓度为横坐标，以色谱峰或峰面积为纵坐标，绘制标准曲线B.5.4 试样溶液的测定将待测液注入高效液相色谱仪中，得到峰高或峰面积，根据标准曲线得到的待测液中有机酸的浓度B.6 结果计算试样中有机酸含量按（B.1）计算：X=C(V+mw）n1000m1000（B.1）式中：X试样中有机酸的含量，单位为克每千克（g/kg）；C由标准曲线求得试样溶液中某有机酸的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；V制备青贮饲料浸提液时水的体积，单位为毫升（mL）；m制备青贮饲料浸提液所用青贮饲料质量，单位为克（g）；w青贮饲料中水的质量分数；n样品稀释倍数；1 000换算系数。