溶血卵磷酯对内皮细胞CD73的调节作用【医学论文】.doc

医学论文-溶血卵磷酯对内皮细胞 CD73 的调节作用【关键词】 腺苷 内皮细胞 胞外 5 核苷酸酶1 材料和方法1.1 材料细胞培养皿、培养液及细胞柱购自 Promocell 公司；试验所用试剂乙烯单磷酸腺苷（eAMP）、溶血卵磷脂（LPC）、白屈菜赤碱、AOPCP (α β 甲基腺苷5 二磷酸)、NBTI (n 硝基苄基 硫代次黄嘌呤核苷)购自 Sigma 公司. 1.2 方法方法分离培养 PAEC, 所得第三代 PAEC 用于实验. 采用 Deussen 等［1］ 首先描述的细胞柱方法，分析测量 PAEC 的腺苷分泌. 本文进行两组实验，每组采用10 个细胞柱. 每 3 min 持续收集一管流出液，每组观察对象收集 5 管流出液. 一组细胞柱中先后泵入 eAMP（5 μmol/L），腺苷膜转运抑制剂（NBTI，1 μmol/L）， LPC(25 μmol/L） 及胞外 5 外核苷酸酶抑制剂（AOPCP，50 μmol/L）. 另一组细胞柱按顺序泵入以下试剂：eAMP（5 μmol/L），NBTI（1 μmol/L），蛋白激酶 C（PKC）抑制剂白屈菜赤碱(100 μmol/L），LPC(25 μmol/L）. 应用高性能液相色谱仪(HPLC)测定腺苷及乙烯 腺苷含量. 提取细胞柱中所有的 PAEC，以 Lowry 等［２］所描述的方法测定其蛋白含量.2 结果两组细胞柱在仅泵入 eAMP 时细胞柱中 PAEC 合成产生内源性腺苷(5.0±1.8) pmol/ min﹒mg-1. NBTI 使此值显着升高至(9.7±3.9) pmol/ min·mg-1 (P0.05,vs 对照）. 当泵入 LPC 后，此比率显着升高至 67.2％±12.0% (P0.05，vs NBTI时）.此时 eAMP 转换生成 eAD 比率为 35.0%±2.8%,与前一情况下相比差别亦无统计学意义（P>0.05，vs NBTI 时）.3 讨论近年来有研究表明腺苷参与缺血预适应及后适应，有极强的心脏保护作用［3］，从而使体内腺苷的分泌及其调节受到人们广泛的关注. 然而由于腺苷可经细胞膜在细胞内外之间转运，且在细胞内迅速代谢，难以准确测定细胞外腺苷合成变化，故关于胞外腺苷分泌及 CD73 活性调节的数据较少. 本研究采用AMP 及腺苷的相似化合物 eAMP 对 CD73 活性进行观察. 结果显示，NBTI 抑制腺苷的膜转运后，腺苷分泌率较生理情况下升高近一倍，表明生理状态下，细胞外生成的腺苷近一半被转运入细胞. 其原因可能为细胞内腺苷快速代谢，造成细胞内外腺苷浓度阶差，使细胞外腺苷顺此阶差转入细胞内. 此结果与本研究小组对人脐静脉内皮细胞的研究结果一致［4］. 而泵入 NBTI 后 eAMP 转换生成eAD 的比率与模拟生理情况下相比无改变，表明 eAMP 及由其经 CD73 转换生成的乙烯 腺苷不能转运入细胞膜，注入 eAMP 后测定生成的乙烯 腺苷可很好地反映 CD73 的活性. 给予 PKC 兴奋剂 LPC，使 PAEC 合成内源性腺苷及 eAMP 转换生成 eAD 的比率均显着增加，表明 LPC 可以兴奋 CD73，显着增加细胞外腺苷分泌. 本研究在 10 个细胞柱试验中以白屈菜赤碱抑制 PKC 后，再观察 LPC 对CD73 活性的影响. 结果显示此时 LPC 对 CD73 的兴奋作用被消除，PAEC 自身腺苷分泌率及 eAMP 转换生成 eAD 的比率与泵入 LPC 前无显着变化. 从而进一步证明 LPC 兴奋 CD73 的作用是通过 PKC 而产生. 在泵入 AOPCP 使细胞的自身腺苷分泌率及 eAMP 生成 eAD 的转换率显着降低，进一步证明细胞外腺苷是经 CD73 合成的.通过本实验，我们得出以下结论：（1）PAEC 腺苷细胞内代谢非常迅速，从而使生理状态下腺苷由细胞外转入细胞内；（2）LPC 可兴奋 PAEC 细胞外5 核苷酸酶，增加腺苷分泌；（3）LPC 兴奋 CD73 的作用与 PKC 有关.【参考文献】［1］Deussen A, Bading B, Kelm M, et al. Formation and salvage of adenosine by macrovascular endothelial cells［J］. Am J Physiol, 1993, 264: H692-700.［2］Lowry O.H, Rosebrough N.J, Farr A.L, et al. Protein measurement with the folin phenol reagent［J］. J Biochem, 1951,193: 265-275.［3］Morrison RR, Tan XL, Ledent C, et al. Targeted deletion of A2A adenosine receptors attenuates the protective effects of myocardial postconditioning［J］. Am J Phsiol Heart Circl Physiol, 2007, 293(4):H2523-9. ［4］张群英,Deussen A.人血管内皮细胞中腺苷代谢的定量研究［J］. 中国应用生理学杂志,2005,11:440-442.。