克隆柞蚕免疫相关基因克隆和诱导表达.docx

克隆柞蚕免疫相关基因克隆和诱导表达 　　昆虫免疫主要是以产生的抗菌肽、抗病毒因子、凝集素、溶菌酶及蛋白酶抑制剂等多种活性物质,配合多种功能的血细胞建立的一个开放防御体系.昆虫仅具有先天性免疫,不具有适应性免疫.昆虫的先天免疫系统主要分为细胞免疫和体液免疫2大部分.体液免疫中转录因子Rel/ NF-κB介导的信号转导通路主要有Toll通路和Imd通路[1],昆虫主要通过这2种通路抵抗微生物的侵染. 　　研究发现,这2种通路通过激活不同的Rel/ NF-κB家族成员调控不同抗菌肽基因的表达,其中Toll通路主要激活转录因子Dorsal和Dif,Imd通路主要激活转录因子Relish[1-5].已知的Rel/ NF-κB蛋白家族成员有8种,哺乳动物中有5种,昆虫细胞中的3种分别是Dorsal、Dif和Relish.其中Dorsal和Dif无锚定重复序列,Relish有锚定重复序列. Rel/ NF-κB蛋白的主要功能是调节机体免疫应答、炎症反应、细胞凋亡和生长发育,炎症、癌症、自身免疫疾病等病理过程与NF-κB的过度活化相关[6]. 　　由于Rel/ NF-κB介导的Toll通路与Imd通路在无脊椎动物和脊椎动物中非常保守[1,7],因此,对昆虫Rel/ NF-κB的研究不仅能够系统了解昆虫的先天免疫机制,而且可为深入了解高等动物的免疫机制及疾病防治提供重要依据.尽管Rel/ NF-κB蛋白在先天免疫过程中起着非常重要的作用,但目前为止尚未见到有关柞蚕Rel/ NF-κB家族成员的报道.本项研究利用生物信息学方法和分子生物学技术,以柞蚕蛹为试验材料,克隆柞蚕免疫相关基因Apdorsal的全长cDNA序列,并将其编码的氨基酸序列与其它物种的Rel/ NF-κB氨基酸序列进行比对及构建系统进化树,利用实时荧光定量PCR技术检测Apdorsal基因经不同微生物诱导处理后的组织表达变化,为探讨柞蚕的先天免疫机制提供参考. 　　1材料与方法 1.1材料和主要试剂 供试柞蚕品种为青6号,柞蚕蛹由辽宁省蚕业科学研究所惠赠,4 ℃条件下保存备用.大肠杆菌(E.coli)Top10、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、柞蚕核 型 多 角 体 病 毒(ApNPV)等微生物由本实验室保存.Trizol试剂,Reverse Transcriptase M-MLV试剂盒,ExTaq酶,凝胶回收试剂盒,pMD18-T载体,T4-DNA连接酶,限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ,RLM-RACE试 剂 盒, SYBR-PrimeScript-RT-PCR Kit(Perfect Real Time),均购自宝生物工程(大连)有限公司. 　　1. 2柞蚕蛹总RNA提取及目的基因的RT-PCR扩增 取20 μL培养过夜的E.coliTop10,注射到柞蚕蛹体内,12 h后解剖取脂肪体组织,用Trizol试剂提取柞蚕蛹脂肪体总RNA,然后按照Reverse Tran-scriptase M-MLV试剂盒说明书将提取的总RNA反转录成cDNA. 　　根据GeneBank登录的烟草天蛾Dorsal(登录号:ADK39025)、家蚕Rel(登录号:NP_001036896)和冈比亚按蚊Rel(登录号:XP_310177)的cDNA序列设计简并引物F(5′-TGCGARGGMCGSTCGG-3′)、R[(5′-CATKGCCTTCTTRTCG(T/ A) AGATG-3′)].简并引物F/ R进行cDNA片段扩增,反应条件如下:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性3 s,55 ℃退火30s,72 ℃延伸30 s,35个循环;72 ℃终延伸7 min.PCR产物经电泳检测后纯化回收,连接到pMD18-T载体,转化E.coliTop10感受态细胞,通过酶切鉴定筛选阳性克隆,送至宝生物工程(大连)有限公司进行测序分析. 　　1. 3目的基因的RLM-RACE扩增 根据"1. 2"中扩增得到的cDNA序列设计RACE扩增特异引物:Dor-5′RACE outer primer(5′-CCAGGTTGTGCGAGTGAGGC-3′),Dor-5′RACE innerprimer(5′-ATTGTAGGGTAGGTGCGGTTCTCG-3′),Dor-3′RACE outer primer(5′-CTCGGCATCCAGTGCGTCAA-3′),Dor-3′RACE inner primer(5′-GGAATCACCCGC-AGAGCATC-3′). 5′-RACE和3′-RACE扩增分别按照RLM-RACE试剂盒说明书进行,PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、纯化回收后连接到pMD18-T载体,转化E.coliTop10感受态细胞,通过酶切鉴定筛选阳性克隆,送至宝生物工程(大连)有限公司进行测序. 　　1.4目的基因的序列分析 测序结果用GenBank的BLAST比对,并用软件Expasy进行蛋白质分子质量和等电点分析.获得的柞蚕Dorsal基因用软件BLASTW进行氨基酸序列同源性比对,并用MEGA5. 0软件构建系统进化树. 　　1. 5不同微生物对柞蚕蛹的诱导处理及各组织总RNA提取 取30只健康柞蚕蛹随机分为5组,每组6只,雌雄各3只.第1组为空白对照;第2组注射50 μLE.coliTop10[D(600 nm)= 1. 2,用无菌水稀释 10倍];第3组注射50 μL枯草芽孢杆菌[D(600 nm)=1. 2,用无菌水稀释10倍];第4组注射50 μL毕赤酵母[D(600 nm)= 1. 2,用无菌水稀释 10 倍];第 5组注射50 μL ApNPV(2×106mL-1病毒悬液,用无菌水稀释10倍).用一次性无菌注射器从柞蚕蛹第1腹节处注射,常温孵育24 h后,分别取柞蚕蛹的表皮、生殖腺、脂肪体、血淋巴、头部、气管6个组织器官,加液氮研磨成粉后,用Trizol试剂提取总RNA,然后按照Reverse Transcriptase M-MLV说明书将提取的总RNA反转录成cDNA. 　　1. 6目的基因表达的实时荧光定量PCR检测 1. 6. 1引物设计根据获得的柞蚕Dorsal基因序列设计real-time PCR引物: QTF-ApdorsalA(5′-AG-GATCATTTACGCTGGAGGTACG-3′), QTR-ApdorsalA(5′-CTTCTCAGTTTCAACAGGTGTCCG-3′);QTF-Ap-dorsalB ( 5′-TGCGCGAGTGTCAGTGTAGTTTGA-3′),QTR-ApdorsalB(5′-CGCAGTGTTCGCTTCCAAGAA-TCA-3′).以组成型表达的柞蚕β-actin基因作为内参,引物为:A3F(5′-ACCAACTGGGACGACATGGA-GAAA-3′),A3R(5′-TCTCTCTGTTGGCCTTTGGGT-TGA-3′). 　　1. 6. 2实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR反应采用荧光染料SYBR Green(R)Ⅰ在Rotor Gene3000-6实时荧光定量基因扩增仪(上海天呈科技有限公司)上进行.按照SYBR-PrimeScript-RT-PCRKit说明书配制25 μL反应体系:cDNA模板2 μL,2×SYBR Premix ExTaq酶12. 5 μL,10 μmol/ L正向引物0. 5 μL,10 μmol/ L反向引物0. 5 μL,RNaseFree dH2O 9. 5 μL. PCR反应条件: 95 ℃预变性30s,30个循环(95 ℃变性3~5 s,60 ℃退火/延伸20s). 　　反应结束后,20 min缓慢升温绘制熔解曲线,利用Botor Gene 6软件的2-ΔΔCt方法[8]对目标基因的表达水平进行分析. 　　2结果与分析 2.1Apdorsal基因的获得与序列特征 利用RLM-RACE扩增从柞蚕蛹脂肪体中克隆得到了2个Apdorsal基因的cDNA序列,分别命名为ApdorsalA和ApdorsalB (登 录 号: JF488068、JF488069).其中,ApdorsalA的cDNA全长1 872bp,有一个1 158 bp的开放阅读框(266~1 423 nt),编码386个氨基酸,该cDNA还包括265 bp的5′端非编码区和449 bp的3′端非编码区;ApdorsalB的cDNA全长1 860 bp,有一个1 008 bp的开放阅读框(404~1 411 nt),编码336个氨基酸,该cDNA还包括403 bp的5′端非编码区和449 bp的3′端非编码区. 　　推导的氨基酸序列中都包含Rel/ NF-κB蛋白家族的特征区RHD,但是3′端没有Dorsal蛋白通常所具有的TD转录激活区(图1). 　　将ApdorsalA蛋白与其它物种的Rel/ NF-κB家族蛋白进行全长氨基酸序列比对,结果显示柞蚕ApdorsalA蛋白与Dorsal、Dif、P65都属于无锚定重复 序 列 的 一 类 蛋 白, ApdorsalA与 烟 草 天 蛾MsDorsal、家蚕BmRelA、冈比亚按蚊Gambif、皱纹盘鲍AbRel、人Hsp65、褐家鼠Rnp65、果蝇DmDif、家蚕BmReish1和果蝇DmRelish的序列相似度分别为78%、70%、56%、48%、45%、45%、41%、32%、34%. 　　应用MEGA5. 0软件构建柞蚕ApdorsalA蛋白与其它物种Rel/ NF-κB蛋白的系统进化树,结果显示ApdorsalA蛋白与烟草天蛾Msdorsal、家蚕BmRelA蛋白有较近的亲缘关系(图2). 　　2.2Apdorsal基因mRNA组织分布及不同微生物诱导的表达变化 为了进一步了解Apdorsal基因在柞蚕不同组织中的表达情况及Apdorsal是否参与了对不同微生物的免疫应答反应,利用real-time PCR技术以柞蚕β-actin基因为内参检测各种组织中ApdorsalA和ApdorsalB基因mRNA的转录情况.结果表明2个Apdorsal基因mRNA在柞蚕蛹各组织中都有转录,在表皮和气管中的转录水平最高,在脂肪体和头部中的转录水平次之,在血淋巴中的转录水平较低.柞蚕蛹脂肪体中的Apdorsal基因mRNA经ApNPV诱导处理后的转录水平最高,经毕赤酵母和枯草芽孢杆菌诱导处理后的转录水平次之,经E.coli诱导处理后的转录水平最低(图3). 　　3讨论 本实验克隆得到了2个编码柞蚕Dorsal蛋白的cDNA序列,二者的5′端部分序列不同,推导的氨基酸序列仅仅是N端的5。