分子生物学：第三章-3.1&2-RNA转录.ppt

第三章 RNA的转录RNA transcription,本章主要内容,3.1 RNA的结构、分类和功能 3.2 RNA转录 3.3 转录后加工 3.4 RNA 复制 （延伸阅读）,3.1 RNA的结构、分类和功能,嘌呤,嘧啶,A腺嘌呤,G鸟嘌呤,C胞嘧啶,U尿嘧啶,磷酸,核糖,含氮碱基,3.1.1 RNA 的结构,RNA,RNA通常是单链线性分子,RNA 自身折叠形成局部双螺旋（二级）结构,发夹结构,凸结构,环结构,存在许多短的双螺旋结构 茎环结构，如发夹结构、凸结构、环结构等 在发夹中，一条RNA链上的两个节段是反向平行走向的，可形成碱基对而产生双螺旋区 GC和AU对之外，还有较弱的GU对加强二级结构的形成,tRNA的二级结构三叶草结构,存在复杂的三级结构,三级结构 倒L形,3.1.2 三种 RNA 类型,mRNA, messenger RNA, 编码特定蛋白质序列，translated RNA tRNA, transfer RNA 能特异解读 mRNA 中的遗传信息, 并携带相应氨基酸加入到多肽链, non-translated RNA rRNA, ribosomal RNA 参与核糖体组成的 RNA 分子, non-translated RNA,3.1.3 RNA的功能,作为细胞内蛋白质生物合成的主要参与者 部分RNA可作为核酶催化一些重要的反应 参与基因的表达调控 在某些病毒中，RNA是遗传物质,本章主要内容,3.1 RNA的结构、分类和功能 3.2 RNA转录 3.3 转录后加工 3.4 RNA 复制 （延伸讲解）,3.2 RNA转录, 中心法则核心内容 基因是能够自主复制、永久存在的单位，其生物学功能可以蛋白质的形式表达,DNA,mRNA,转录,翻译,Protein,复制后永存,表达后控制生命现象,复制, 转录，transcription 以 DNA 为模板合成 RNA 的过程，是基因表达的一部分,基因组DNA一部分 双链DNA中的一条链，转录是不对称的,编码链，coding strand 有义连， sense strand 正链， plus strand, positive strand 基因组中编码蛋白质的 DNA 链，即与 mRNA 序列相同的那条 DNA 链，与模板链互补 模板链，template strand； 负链， negative strand 非编码链， non-coding strand 反义链，antisense strand 根据碱基互补原则指导 mRNA 合成的那条 DNA 链, DNA 双链与转录的 RNA 链之间的关系, DNA 模板与 RNA分子及多肽链之间存在共线性关系,转录和复制,相同点 酶促的核苷酸聚合过程 以DNA为模板，聚合酶多依赖DNA双链 聚合每次只延长一个核苷酸 核苷酸之间连接都是磷酸二酯键 都遵循碱基配对原则 链延伸方向是5,不同点 复制两条链，转录仅用一条链 复制产物与亲代具高保真性，转录产物结构基因U、T互换，成熟RNA序列与模板链相差较远 转录不需要引物，新合成的RNA原料是4种核糖核苷酸等 转录反应一般只用一小段DNA做模板,3.2.1 RNA 转录基本过程,在原核、真核细胞中，转录基本过程包括 4 步： 1) 模板识别 2) 转录起始 3) 转录延伸 4) 转录终止,3.2.2 模板识别及转录复合物主要成分, 一个转录区段可被视为一个转录单位，包括若干个结构基因及其上游的调控序列，模板和酶发生特异性识别与结合, RNA 聚合酶，RNA polymerase, RNA pol,以 DNA 或 RNA 为模板合成 RNA 的酶（以 DNA 为模板为 DNA-dependent RNA pol, 以 RNA为模板为 RNA-dependent RNA pol） 序列高度保守，原核生物和真核生物的RNA聚合酶亚基间有同源性 只有 53 的聚合酶活性，没有外切酶活性 不需要引物，直接催化 RNA 从头合成 启动转录需要识别启动子，保证特异性 底物为4种三磷酸核苷酸：ATP，GTP， UTP 和 CTP 需要其它起始蛋白的存在，聚合酶才能与启动子结合并诱导起始,一、 RNA 聚合酶，RNA polymerase, RNA pol,原核生物一种RNA pol 负责mRNA, rRNA, tRNA 转录大肠杆菌 RNA 聚合酶的组成分析,E. coli RNA pol 组成, 因子的功能, 因子指导核心酶转录特异基因 促使全酶识别 Sextama Box (-35 区) TTGACA，负责模板链的选择和转录的起始 可以重复使用 存在多种 因子，用于识别不同的启动子 主要有 7 种 因子，参与基因转录最多的是70,二、转录复合物前体（pre-initiation transcription complex, PITC）,启动子选择阶段形成封闭复合物，此时，DNA 仍处于双链状态 随后，封闭复合物转变成开放复合物，聚合酶全酶所结合的 DNA 序列中有一小段双链被解开 开放复合物与最初的两个 NTP 结合转变成包括RNA 聚合酶、DNA 和新生 RNA 的三元复合物,5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN OH + ppi, 原核生物起始复合物：RNApol - DNA - pppGpN- OH,细菌 RNA pol 转录起始复合物,细菌 RNA pol 的循环,三、真核生物具有三种类型 RNA 聚合酶，分工不同,hn RNA: heterogeneous nuclear RNA, 核不均一 RNA, 核内最初转录的 RNA, 加工后形成 mRNA,(hnRNA), 原核生物一种 RNA 聚合酶负责 三种 RNA 转录,3种聚合酶都由2个大亚基，12个以上的小亚基组成 至少5个小亚基的基因编码区具有同源性；4-7种小亚基为各种RNA聚合酶特有 都具有原核RNA聚合酶核心2同源的亚基 RNA聚合酶II的两个大亚基RBP1和RBP2，与细菌核心酶的同源 RBP3和RBP11与同源、 RBP6与同源,RNA Pol II的羧基末端结构域（CTD）,RNA Pol II最大亚基的羧基端, 含有7个氨基酸的重复序列: Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser 在哺乳类中重复52次，在酵母中重复26次，称为 (Carboxyl- terminal domain) CTD 转录起始时： Ser、Thr 的羟基非磷酸化，易与DNA 结合 转录延伸时，磷酸化，松弛与DNA的结合,3.2.3 启动子（Promoter）与转录起始,决定 RNA 聚合酶转录起始位点的 DNA 序列 基因精确转录和特异性启动所必需的 DNA 序列 定位转录起点，决定转录效率 一般位于一个基因的上游（转录起始点上游） 序列高度保守、特异, 真核生物器官、组织特异启动子 控制基因或性状表达的关键元件,一、确定启动子区域的方法,体外鉴定：DNA 酶足迹分析（DNasefootprint assay） 启动子序列因 RNA pol 的特异结合而受到保护，不会被 DNA 酶降解，序列分析受到保护的 DNA 区段，确定 RNA pol 结合的序列 遗传分析：启动子不同区段与报告基因连接，遗传转化后分析转化子中报告基因表达量，鉴定启动子序列 报告基因（Reporter gene）：用于反映基因表达效率的可编码易于检测的蛋白质或酶的基因,体外鉴定：受 RNA 聚合酶保护的 DNA 片段,遗传分析：报告基因鉴定启动子片段,缺失区域,二、 启动子区基本结构,启动子位于结构基因 5 端上游的 DNA 序列，与 RNA 聚合酶准确结合, 具转录起始的特异性,RNA,转录区域,编码链 模板链,启动子,终止子,转录,1 1,转录起始点,DNA,大肠杆菌 RNA 聚合酶全酶所识别的启动子区,保守区,保守区,-10序列：,-10序列是由Pribnow和Schaller（1975）发现，故也称为Pribnow框盒 保守序列为TATAAT 位于-10bp左右，A.T较丰富，易于解链。

其功能是: (1) RNA pol紧密结合 (2) 形成开放启动复合体 (3) 使RNA pol定向转录,-35序列,其保守序列为TTGACA 其功能是: (1) 为RNA pol的识别位点 亚基识别-35序列，为转录选择模板 (2) -35和-10序列的距离是稳定的，此与RNA pol的结构有关,5,5,RNA 聚合酶保护序列,结构基因,3,3,1,-30,-50,10,-10,-40,-20,5 3,3 5,开始转录,T T G A C A A A C T G T,-35区,辨认位点,T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10区,Pribnow box, TATA box,原核生物启动子保守序列, Pribnow box,真核生物 RNA 聚合酶所结合的启动子区,水稻籽粒基因，在启动子1000 bp处缺失12 bp, 功能丧失 Nature Genetics, 李一博等，2011,三、启动子区识别机理,RNA 聚合酶不直接识别碱基，而是通过氢键互补方式识别, 故启动子的功能既受 DNA 序列影响，又与其构象有关 DNA 双螺旋中的碱基，是氢键供体（腺嘌呤 N6、鸟嘌呤 N2、胞嘧啶 N4）和受体（腺嘌呤 N7 和 N3、胸腺嘧啶O4 和 O2 等），位于大、小沟内，具特定方位 酶也有特定构象的氢键供体、受体，它与 DNA 互补可形成氢键 保守区碱基改变影响局部电荷密度及构象，影响启动子与酶互作，影响转录,四、RNA聚合酶与启动子结合方式, RNA 聚合酶结合到启动子上的两种方式,RNA 聚合酶 直接结合,RNA 聚合酶 间接结合,结合,解链,重绕,模板链,真核 RNA 聚合酶所形成的转录起始复合物,真核生物 RNA pol II 与转录因子参与基因转录,TBP（或TFD以及TFA）,TFB,TFF-RNA聚合酶,TFE,TFH,TFA,TFD,RNA聚合酶,TFF,TFE,TFH,TBP,TFB,封闭聚合物,TATA-binding protein, TBP Transcription factor, TF,TFE,TFH,延伸因子,RNA,终止,P,P,P,释放RNA聚合酶，去磷酸化,五、真核 RNA pol 和 pol 介导的基因转录,recursor rRNA (pre-rRNA, rRNA前体) 组成一个长转录单元，多个拷贝，首尾相连，场所为核仁区 真核细胞转录三个 rRNA 分子的方向相同（5 18S 5.8S 28S 3），共享一个启动子及终止子，转录的 pre-rRNA 为 45S rRNA 无论原核还是真核生物，pre-rRNA 转录单元都显著长于成熟 rRNA 的总和, RNA Pol I 只用于合成 pre-rRNA，三大特征：, 真核细胞 rRNA 基因的结构和组织,特例：真核生物中的多顺反子（前体）,三个RNA 来自一个转录单元，三个RNA分子的摩尔分子数比例相同, RNA pol介导的基因转录,UCE: 上游调控序列 UBF: 上游绑定因子 SL1: 选择性因子 TAF: TBP相关因子,tRNA外 5S rRNA（不包括在前面提到的三个基因一起转录的单元中） snRNA (small nuclear RNA)., RNA Pol III 转录产物, RNA pol III 催化转录的基因的启动子结构 内部启动子：与转录复合体结合，本身也被转录,TGGCNNAGTGG,GGTTCGANNCC,DSE: distal sequence element, 远端序列元件,PSE: proximal sequence element, 近端序列元件, RNA pol 介导的基因转录,BRF: Basal regulatory factor,真核生物 RNA Pol 本身不能识别和结合到启动子上，需要TF识别结合后，和 RNA pol 一起装配成转录复合物,六、原核生物核心启动子元件 -1。