临床微生物实验室细菌鉴定指南.docx

临床微生物试验室细菌鉴定指南〔上〕录入时间:2023-11-22 10:40:51 来源：温州医学院附属医院一．细菌的鉴定步骤1. 鉴定的概念：将一个未知的菌株按其生物学特性，经过与全部菌种进展比较后划归到一个菌种的分析过程2. 对待鉴定的菌种要明确已经获得纯化培育或者该菌种在血平板上生长良好，有单个菌落可以进展生化试验〔我们这里一般都是预先纯化培育〕3. 对待鉴定的菌种进展革兰染色，观看形态〔G+c，G–b，G–c，G+b〕，做触酶， 氧化酶试验，然后按科，属，种逐步鉴定要留意对待鉴定的菌种选择一个适宜的鉴定系统，临床常见细菌的快速简洁的鉴定系统我们都已经设计好，参考鉴定质控单4. 按鉴定质控单的要求填写好病人姓名，年龄，性别；标本类型，标本编号，送检日期等另外最重要的是要填写好该菌种的菌落形态以及有无溶血5. 复习革兰染色，触酶试验，氧化酶试验⑴．革兰染色：是细菌鉴定过程中最常用最根本最重要的染色方法首先要将待鉴定的细菌涂片，固定〔目的：杀死细菌，转变细菌对染料的通透性〕第一步：以结晶紫初染〔染色液Ⅰ〕其次步：以卢戈氏碘液媒染〔染色液Ⅱ〕第三步：用 95%乙醇脱色〔染色液Ⅲ〕第四步：最终用稀释复红复染〔染色液Ⅳ〕⑵．触酶试验(H O 试验)：2 2a.原理：具有过氧化氢酶的细菌能催化双氧水生成水和初生态氧，继而形成氧分子消灭气泡。

b.方法：一般用玻片法，就是挑取菌落在干净的玻片上涂开，滴加 3%过氧化氢数滴，观看结果〔马上有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性〕要留意不能在血平板上进展试验，这样易消灭假阳性；另外陈旧菌落要是进展试验可能会导致假阴性结果；还有不能在接种针或环上进展试验c.阳性比照用金黄色葡萄球菌，阴性比照用链球菌；试剂要避光置 4℃冰箱保存d.应用：绝大多数含细胞色素的需氧和兼性厌氧细菌触酶试验阳性，链球菌属阴性临床常见细菌鉴定试验中我们一般用于区分葡萄球菌属〔+〕，微球菌属〔+〕，链球菌属〔－〕⑶．氧化酶试验〔Kovac 试验〕：原理：氧化酶又称细胞色素酶，是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶酶并不直接与试剂〔1%盐酸四甲基对苯二胺〕起反响，而是首先使细胞色素c 氧化，然后氧化型细胞色素 c 使对苯二胺氧化，消灭深兰色反响方法〔滤纸法，菌落法，试剂纸片法〕：a.b.一般我们承受滤纸法，取白色干净滤纸条，沾取菌落少许，加试剂一滴，阳性者马上呈粉红色，继而消灭深兰色结果读取在10 秒钟时为最正确，60 秒内读取牢靠本试验避开接触含铁物质〔假阳性〕，也不能在含糖培育基上生长的菌落进行试验〔假阴性〕c. 阳性比照用铜绿假单胞菌，阴性比照用大肠埃希菌。

d. 应用：奈瑟氏属的菌种均阳性，也用于区分假单胞菌属和肠杆菌， 前者阳性，后者阴性二．葡萄球菌属的鉴定葡萄球菌属主要的种有金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌1. 形态与染色：葡萄球菌直径 0.5～1.5μ m，菌体圆形，呈单个，成双以及不规簇状排列染色呈紫色，为革兰阳性球菌2. 与链球菌的区分：触酶试验为阳性，而链球菌阴性；菌体形态链球菌小于葡萄球菌，呈成双和链状排列的卵圆形的革兰阳性球菌3. 与微球菌的区分：触酶试验同为阳性，但微球菌的菌体呈四联状，要大于葡萄球菌，微球菌葡萄糖氧化发酵试验〔操作方法同甘露醇 OF 试验〕为氧化型；而葡萄球菌为发酵型另外呋喃唑酮〔即痢特灵 50μ g/片〕敏感试验微球菌为耐药，而金黄色葡萄球菌为敏感4. 葡萄球菌属的种间鉴定：⑴．菌落色素与溶血毒素：金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄色，柠檬色或者淡黄色，而其他葡萄球菌则在血平板上菌落大多数为白色，也有局部为柠檬色或深黄色⑵．溶血毒素：金黄色葡萄球菌有α ﹑β ﹑γ ﹑δ 溶血毒素，各毒素的区分是对动物红细胞的溶血范围﹑抗原性及溶血时的温度等其中以α 溶血毒素为主而其他葡萄球菌大多数不产生溶血毒素，只有表葡有极少能产生溶血毒素。

⑶．血浆凝固酶试验：用与区分金黄色葡萄球菌〔阳性〕，表皮葡萄球菌〔阴性〕， 腐生葡萄球菌〔阴性〕血浆凝固酶是金葡菌所产生的，有结合凝固酶和游离凝固酶两种血浆凝固酶检测有两种方法，为玻片法和试管法，我们一般承受玻片法a. 操作方法：挑取少许金黄色葡萄球菌菌落在玻片上与血浆乳化，结合凝固酶能作用于血浆中的纤维蛋白原，从而在金黄色葡萄球菌外表发生凝集，所以我们肉眼能观看凝集颗粒玻片法主要由结合凝固酶作用产生；游离凝固酶是金黄色葡萄球菌产生的胞外酶，能与血浆中的血浆凝固反响因子〔类似凝血酶的一种物质〕作用，形成复合物再使纤维蛋白原转化成纤维蛋白而发生凝集试管法主要由游离凝固酶作用产生b. 留意事项：菌落不能太多，否则会影响结果观看；凝固酶阳性要做自凝阴性比照〔用生理盐水代替血浆〕，只有在阴性比照也不凝集才能认为是真正的阳性， 有一局部葡萄球菌有自凝现象⑷．生霉素敏感试验：金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌对生霉素纸片〔5μg/片〕 敏感；而腐生葡萄球菌，微球菌则对之耐药抑菌环直径>16mm 即为生霉素敏感⑸．甘露醇氧化发酵试验：a.操作方法：取两支甘露醇微量生化管，在微量管内接种待检细菌，然后一支加两滴石腊密封，另外一支则不加，放 37℃孵箱内 18～24h 后观看结果。

b.结果观看：微量生化管变黄色为阳性，也就是能利用甘露醇假设两管都变黄色则说明是发酵型；其中加石蜡管不变色，没加石蜡管变黄色则为氧化型；假设两管都不变色则说明该细菌是不利用甘露醇〔产碱型〕c.应用：金黄色葡萄球菌在需氧和厌氧的条件下都能利用甘露醇〔即两管都变黄色〕；表皮葡萄球菌需氧局部产酸，厌氧条件下不利用甘露醇〔即没加石蜡管有局部会变黄色，加石蜡管不变黄色〕；腐生葡萄球菌与表皮葡萄球菌类似三．微球菌属的种间鉴定微球菌属主要的种有易变微球菌，藤黄微球菌，玫瑰微球菌鉴定生化见下微球菌属的种间鉴定表易变微球菌藤黄微球菌玫瑰微球菌色素产生黄色黄色粉红色需氧葡萄糖产酸＋＋－硝酸盐复原＋－－脲素酶dd＋氧化酶〔弱〕－＋－/＋生霉素敏感S/RSRd：不定S：敏感R：耐药四．链球菌属1. 形态和染色：链球菌的直径为 0.5～1.0μ m，呈成双和链状排列的卵圆形革兰阳性球菌，菌体小于葡萄球菌，无鞭毛，没有芽胞，但有些菌株会形成荚膜肺炎链球菌呈矛头状，宽端相对，尖端向外2. 依据链球菌在血平板上溶血现象的不同分为三种：⑴甲型〔α -〕溶血，即菌落四周消灭较窄的草绿色溶血环；⑵乙型〔β -〕溶血，即菌落四周消灭较宽的透亮溶血环；⑶丙型〔γ -〕溶血，即菌落四周无溶血环。

3. 依据抗原构造〔C 多糖抗原〕的不同可分为 A﹑B﹑C﹑D﹑E﹑F﹑G﹑H﹑K﹑L﹑M﹑N﹑O﹑P﹑Q﹑R﹑S﹑T 等 18 个群，对人类有致病者 90%属于 A 群，偶见其他群链球菌致病4. 链球菌属的种间鉴定⑴．乙型溶血链球菌的鉴定：a. 对杆菌肽〔0.04U/片〕〔抑菌圈直径≥10mm〕敏感：A 群链球菌〔主要为化脓性链球菌〕b. 对杆菌肽不敏感，胆汁七叶苷试验阴性，但马尿酸钠水解试验﹑CAMP 试验阳性：B 群链球菌〔主要为无乳链球菌〕c. 对杆菌肽不敏感，胆汁七叶苷试验阴性，马尿酸钠水解试验阴性，CAMP 试验阴性：主要为马链球菌﹑类马链球菌﹑兽疫链球菌；对三者的区分试验要加做海藻糖和山梨醇试验d. CAMP 试验：将能产生β -溶血的金黄色葡萄球菌在血平板上划一横线接种，再将待鉴定菌于金黄色葡萄球菌 3mm 处垂直种一短线，假设在有 CO2条件下培育 5～6小时，或无 CO2条件下培育 18～24 小时，在两细菌连接处消灭一个半月型的加强溶血区即为 CAMP 试验阳性⑵．甲型溶血链球菌的鉴定：a. 草绿色链球菌：对杆菌肽敏感，对奥普托欣〔Optochin〕不敏感，胆汁溶菌试验阴性，胆汁七叶苷试验阴性，在高盐中不生长。

主要有变异链球菌，轻型链球菌，血链球菌，唾液链球菌等b. 肺炎链球菌：菌体呈矛头状，成双排列，钝端相对，尖端相背，较葡萄球菌， 其他链球菌略大；在血平板上菌落细小﹑圆形﹑外表光滑﹑灰白色﹑半透亮，开头时菌落呈扁平状，以后中心塌陷，呈脐窝状与草绿色链球菌的主要区分是胆汁溶菌试验阳性，对奥普托欣〔Optochin〕敏感奥普托欣〔Optochin〕含量为5μ g/片，抑菌环>18mm 为敏感，<15mm 为不敏感，15～18mm 应重复试验⑶．肠球菌〔D 群链球菌〕的鉴定：溶血不定，主要是α -﹑γ -溶血；对杆菌肽不敏感，但其特异性试验是胆汁七叶苷试验阳性；假设能在 6.5%NaCl 的心浸液肉汤中生长即为 D 群肠球菌，不能生长为 D 群非肠球菌⑷．链球菌属鉴定的系统生化结果推断a. 1%美兰牛乳b. 胆汁七叶苷试验：变黑为阳性c. PH9.6 肉汤试验：变浑浊为能在碱性环境中生长〔阳性〕d. 6.5%NaCl 心浸液肉汤：由紫变黄为能在高盐环境中生长〔阳性〕e. 精氨酸双水解酶试验：变红色〔比照不变色，仍为黄色〕为阳性临床微生物试验室细菌鉴定指南〔下〕录入时间:2023-11-22 10:44:19 来源：温州医学院附属医院五．奈瑟氏菌属和布兰汉菌属奈瑟氏菌属主要有脑膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌；布兰汉氏菌属只有卡他布兰汉氏菌。

两者系需氧革兰阴性球菌⑴ 奈瑟氏菌的生物学特性：革兰阴性球菌，需氧，卵圆形或肾形，无动力， 氧化酶及触酶均阳性培育时对养分要求高，能在巧克力平板或有丰富养分的血平板上，在 5～10%CO环境中生长2⑵．鉴定过程：a. DNA 酶试验阳性为布兰汉氏菌，阴性则为奈瑟氏菌b. 能在一般血平板上生长的为其他奈瑟氏菌，在巧克力平板上生长的主要为脑膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌c. 能使麦芽糖氧化分解产酸的是脑膜炎奈瑟氏菌，不利用麦芽糖的是淋病奈瑟氏菌⑶．几种主要细菌对葡萄糖﹑麦芽糖﹑蔗糖的氧化分解产酸结果如下：氧化分解产酸菌种葡萄糖麦芽糖蔗糖淋病奈瑟氏菌＋－－脑膜炎奈瑟氏菌＋＋－粘液奈瑟氏菌＋＋＋卡他布兰汉菌－－－⑷ DNA 酶试验：a. 方法：将待鉴定细菌点种于含 0.2%DNA 的DNA 琼脂平板上，培育后用 1mmol/LHCl 掩盖平板，菌落四周消灭透亮环者为阳性b. 原理：某些细菌能产生 DNA 酶，可使 DNA 长链水解成由几个单核苷酸组成的寡核苷酸链；长链 DNA 可被酸沉淀，而水解后形成后的寡核苷酸链则可溶于酸，故在 DNA 琼脂平板加盐酸，可在菌落四周形成透亮的溶血环〔肠杆菌科中只有沙雷氏菌和变形杆菌可产生 DNA 酶，阳性球菌中只有金葡菌能产生 DNA。