米曲霉的培养及蛋白质的分析.ppt

米曲霉的培养及蛋白质的分析 一 实验目的 n通过固态三角瓶培养曲霉 掌握固态培 养微生物原理和技术 并掌握蛋白酶活 性的分析方法 二 实验原理 过程和方法 1 实验原理 2 实验过程 3 实验方法 1 实验原理 n固态培养微生物 是我国传统发酵工业的特色之一 具有悠久的历史 在黄酒 白酒 酱油 酱类等领域 广泛应用 n固态培养方法 Solid state cultivation 主要有散 曲法和块曲法 部分黄酒用曲 红曲及酱油米曲霉培 养属散曲法 而黄酒用曲及白酒用曲一般采用块曲法 n固态制曲设备 实验室主要采用三角瓶或茄子瓶培养 种子扩大培养可将蒸熟的物料置于竹匾中 接种后 在温度和湿度都有控制的培养室内进行培养 工业上 目前主要是厚层通风池制曲 转式圆盘式固态培养装 置正在试验推广之中 日本 台湾已大规模化 机械 化 n固态培养微生物 主要用于霉菌的培养 但细菌 和酵母菌也可采用此法 其主要优点是节能 无 废水污染 单位体积的生产效率较高 我国广泛 使用的厚层通风固态法培养法 空气一般不经过 除菌处理 培养环境也无法做到严格无菌 故染 菌问题未得到根本解决 n本实验所用的米曲霉的生长特性及菌落特征 米曲霉 Aspergillus 属曲霉菌 Aspergillus 菌落初为白色 黄色 继而变为黄褐色至淡绿 褐色 反面无色 2 实验过程 n米曲霉菌种的纯化 单菌落分离 制 成斜面 将斜面菌种接入250ml三角瓶培 养成种曲 再将种曲扩大培养 500ml 三角瓶 米曲霉培养物经水溶液萃取 制得粗酶制剂 取粗酶制剂进行蛋白酶 活力的测定 3 实验方法 米曲霉的培养 n本实验分为斜面种子培养及三角瓶培养两个阶段 三角瓶培养物在工厂常作为一级种子 n试管斜面培养基 豆饼浸出汁 100克豆饼粉 加水500ml 浸泡4小 时 煮沸3 4小时 纱布自然过滤 取液 调整至5 波美度 每100 ml 豆汁中加入可溶性淀粉2克 磷 酸二氢钾0 1克 硫酸镁0 05克 硫酸铵0 05克 琼 脂2克 自然pH n或采用马铃薯培养基 马铃薯200g 葡萄糖20g 琼 脂15 20g 加水至1000ml pH自然 米曲霉的培养基1 麸皮80g 面粉 或小 麦粉 20g 水80ml 米曲霉的培养基2 豆粕粉10g 麸皮90g 水110ml n装料厚度 1cm左右 n灭菌 120 30 60min 三角瓶培养基制备 接种及米曲霉的培养条件 n米曲霉固态培养主要控制条件 温度 湿度 装料量 基质水分含量 n固态培养前 原料的蒸熟及灭菌是同时进行的 实验室一般是在高压灭菌锅中进行 但在工 厂 则原料的煮熟和灭菌与发酵分别在不同的 设备中进行 这点与液态发酵是不同的 28 30 培养20小时后 菌丝应布满培养基 第 一次摇瓶 使培养基松散 每隔8小时检查一 次 并摇瓶 培养时间一般为48 70小时 三 实验仪器 设备和材料 n恒温培养箱或固态培养室 负压式超净 工作台 显微镜 计数器 水浴锅 分 光光度计 试管 茄子瓶 平板及500ml 三角瓶等 n米曲霉菌种 酱油生产用米曲霉 四 实验分析项目和方法 1 米曲霉培养效果测定 n米曲霉孢子计数 显微镜观察 通常 每克曲 干基 孢子数可达100亿以上 2 干物质失重的测定 干重失重 发酵前干重 发酵后干重 3 米曲霉蛋白酶活力的测定 3 1 原理 1 福林试剂在碱性情况下极不稳定 可被酚类化合物还 原而呈蓝色反应 2 蛋白质分子中含有具有酚基的氨基酸 酪氨酸 色氨 酸及苯丙氦酸等 3 以酪蛋白为底物 同酶液反应 经一定时间后 加三 氯醋酸 终止酶反应 并使残余的酪蛋白质沉淀 同水解产 物分开 经过滤后取滤液 用碳酸钠碱化 再加入福林试剂 使之发色 用分光光度计测定 4 蓝色反应的强弱 同蛋白水解产物的多少成正比而水 解产物的量又是同酶活力成正比例关系 因此 根据蓝色反 应的强弱就可推测蛋白酶的活力 3 2 试剂 1 福林试剂 于2000ml磨口回流装置内加入钨酸钠 Na2WO4 2H2O 100g 钼酸钠 NaMoO4 2H2O 25g 水700ml 85 磷酸50m1 浓盐 酸1000ml 文火回流10h 加入硫酸锂 Li2SO4 150g 蒸溜水 50m1 混匀取去冷凝器 加入几滴液体溴 再煮沸l5min 以 驱逐残溴及除去颜色 溶液应呈黄色而非绿色 若溶液仍有 绿色 需再滴加溴液 再煮沸除去之 冷却后 定溶至 1000ml 过滤 置于棕色瓶中保存 此溶液使用时加2倍蒸馏 水稀释 即成稀释的福林试剂 2 0 4mol L三氯醋酸 TCA 溶液 称取三氯醋酸65 4g 定容至1000ml 3 0 4mol L碳酸钠溶液 称取无水碳酸钠 Na2CO3 42 4g 定容至1000m1 4 0 05mol L pH2 5 乳酸 乳酸钠缓冲液 A液 称取10 6g80 90 乳酸加蒸馏水定容至1000ml B液 称取16克70 乳酸钠加蒸馏水定容至1000ml 取A液16ml与B液1ml稀释1倍即成0 05mol L pH2 5 乳酸 乳酸钠缓冲液 5 2 酪蛋白溶液 称取干酪素2g加入0 1mol L氢氧化钠20ml在水浴中加 热使溶解 必要时用小火加热煮沸 然后用pH2 5乳酸 乳 酸钠缓冲液定容至1000ml即成 配制后应及时使用或放入冰箱内保存 否则极易繁殖 细菌 引起变质 配制酪蛋白溶液定容时 若泡沫过多 则可加1 2滴酒 精消泡 3350酸性蛋白酶酪蛋白溶液的配制 应加弄乳酸 2 3滴湿润 6 100 g m1酪氨酸溶液 精确称取在l05 烘箱中烘至恒重的酪氨酸0 1g 逐步 加入0 1mol L盐酸 HCl 使溶解 加蒸溜水定容至100m1 其浓度为1000 g m1 再吸取此液10ml以蒸馏水定容至100ml即配成 100 g m1酪氨酸镕液 此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存 以免繁 殖细菌而变质 3 3 操作步骤 3 3 1 标准曲线的绘制 1 按表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液 2 测定步骤 另取6支试管按上表编号分别吸取不同浓度的酪氨 酸1ml 各加入0 4mo1 L碳酸钠5m1 再加入已稀释的福 林试剂1m1 摇匀置于水浴锅中 40 保温发色20min 在波长 660nm处测定吸光度 一般测3次 取平均值 以吸光度为纵座标 酪氨酸的浓度为横座标 绘制 成标准曲线 准确称取蛋白酶固态发酵的湿曲2g 用10 20ml蒸 馏水 30 浸提半小时 用滤纸过滤 将滤液稀释一定 倍数 使其测定光密度在0 2 0 4范围内为宜 3 3 2 酶液的制备 取四支试管 分别加入1ml稀释酶液 其中一支为空白 管 三支为平行试验管 置入40 水浴中预热3 5min 在三支平行试验管中分别加入1ml 2 酪蛋白溶液 准 确计时保温10min 立即加入2ml 0 4M三氯乙酸溶液 l5min后用滤纸过滤 分别吸取1ml清液 加5ml 0 4M碳酸 钠溶液 最后加入1ml福林 酚试剂 摇匀 于40 水浴中 显色20min 空白管中先加入2ml 0 4M三氯乙酸溶液 再加l ml 2 酪蛋白溶液 15min后用滤纸过滤 以下操作与平行试验管 相同 以空白管为对照 在680纳米波长下测光密度 取其平 均值 3 3 3 测定 蛋白酶活力单位定义 在40 pH2 5下 每分钟水解 酪蛋白释放1微克酪氨酸的酶量定义为1个蛋白酶单位 式中 K 标准曲线中O D值为1所相当的酪氨酸的微克数 OD 平行试验管的平均光密度 4 试管中反应液总体积 毫升 10 反应10分钟 N 稀释倍数 W 曲的称取量 克 3 3 4 计算 1 对于同一台分光光度计与同一批福林 酚试剂 其工作曲线K值可以沿用 当另配福林 酚试剂时 工作曲 线应重作 2 当用不同产品的酪蛋白对同一蛋白酶测定时 其结果会有差异 故蛋白酶活力表示时应注明所用酪蛋白 的生产厂 3 3 5 说明 五 实验报告内容和数据处理 两种培养基米曲霉培养过程中蛋白酶活性 变化规律 。