毛细管电泳法检测肺癌p53基因第七外显子的突变.doc

1毛细管电泳法检测肺癌 p53 基因第七外显子的突变作者：刘勇 王荣 高岚 贾正平 辛晓婷 谢华 马骏【摘要 】 p53 基因点突变在肺癌的发生过程中起重要作用，检测基因点突变的方法学研究将有助于临床准确诊断肺癌本实验用PCR 扩增包含 249 位密码子的肺癌及癌旁正常组织 p53 基因第七外显子，扩增样品分别经 96 ℃变性和 HaeⅢ 酶切处理，以CE SSCP、CE RFLP 、PAGE SSCP 和 PAGE RFLP 对其突变情况进行检测，并从上样量、时间、检出限和检出率 4 个方面进行比较PAGE 凝胶浓度为 15%;CE 筛分介质 PEO 浓度 3.0%，pH 8.2，电压 15 kV，温度 15 ℃，λex=488 nm，λem=520 nm 荧光检测检出率由高到低分别为：CE SSCP>PAGE SSCP>CE RFLP>PAGE RFLPCE SSCP 可作为大规模肺癌早期诊断的简便可靠的方法 【关键词】 肺癌， 基因突变， 毛细管电泳， 聚丙烯酰胺凝胶电泳， 单链构象多态性， 限制性片段长度多态性1 引 言p53 基因是一个具有独特作用的抑癌基因, 突变后具有癌基2因作用，一直是癌症研究的热点[1]，是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因，其第七外显子是突变的集中区域，237～249氨基酸位置的基因编码区是一个高度保守区密切相关的热点区[2]。

通过对肺癌相关基因的研究，将有助于肺癌早期诊断和治疗方案的制定，降低死亡率，促进其它癌症诊断方法学的研究常用检测基因突变的方法有：单链构象多态性(SSCP)、限制性片段长度多态性(RFLP)、温度梯度凝胶电泳 (TGGE)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、DNA 芯片技术、DNA 测序等，其中 SSCP 和RFLP 使用最为广泛这些方法大多与聚合酶链式反应(PCR)相结合，检测手段依赖平板凝胶电泳，在准确性、灵敏度、检测成本及时间等方面存在不足[3,4]近年来，越来越多的研究者将毛细管电泳(CE)用于检测基因突变的研究中Mitchelson 等[5]用 CE 对基因点突变进行了筛查;Felmlee 等[6]研究了 CE 在临床诊断 DNA 方面的潜在作用; 施维等 [7]用自制线性聚丙烯酰胺凝胶电泳柱对寡聚核苷酸的分离进行了研究越来越多的研究表明，与其它检测技术相比，CE 具有高效、快速、样品用量少、自动化程度高等优点，在核苷酸分析方面具有独特的优越性本实验采用 SSCP、RFLP 结合聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)以及 CE 对肺癌 p53 基因突变进行研究，并对这些方法进行了比较，为寻找科学准确的基因诊断方法提供依据。

32 实验部分2.1 仪器与试剂P/ACE System 5000 型毛细管电泳仪、 P/ACE System 5000 station 数据处理软件、P/ACE Systemlaser module 488 nm 激光发射器( 美国 Beckman 公司);石英毛细管柱 (河北永年光导纤维厂)聚环氧乙烷(PEO，Mr=300000); 限制性内切酶HaeⅢ(TaKaRa);丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵(APS，国药集团化学试剂有限公司);γ  甲基丙烯酰基  三(甲氧基) 硅烷(MAPS，A Johson Matthey 公司);三羟甲基氨基甲烷 (Tris，上海山浦化工有限公司);硼酸、乙二胺四乙酸二钠 (EDTA，天津化学试剂厂);SYBR GreenⅠ核酸染料( 厦门百维信公司);pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ)DNA Marker(上海生物工程技术有限公司) 肺癌及癌旁正常组织各 40 例取自兰州军区兰州总医院病理科，所有标本均来自肺部切除并经病理切片证实2.2 组织 DNA 提取，引物设计及 PCR 扩增4酚  氯仿法提取肺癌及癌旁正常组织基因组 DNA。

PP5.0 软件设计 p53 基因第七外显子，包含 249 位密码子突变位点的引物，该位点突变后能引起限制性内切酶 HaeⅢ酶切位点(GGCC)消失，引物由上海生物工程技术有限公司合成上游：5′ TAT CTC CTA GGT TGG CTC TG 3′，下游：5′ TGA CCT GGA GTC TTC CAG T 3′，长度为 124 bpPCR 扩增条件： 94 ℃变性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共 28 个循环2.3 PAGE SSCP 检测扩增产物加入 1/6 体积上样缓冲液，96 ℃变性 15 min，冰浴 5 min，立即上样 3 μL，凝胶浓度为 15%，125 V 电泳 8 h;凝胶作常规 AgNO3 染色2.4 PAGE RFLP 检测酶切体系(30 μL)：HaeⅢ 5U、扩增产物 9 μL、三次蒸馏水18 μL、缓冲液 2 μL37 ℃水浴 1 h，升至 80 ℃灭活 20 min扩增产物经酶切后，以 15%PAGE 检测，样品中加入 1/6 体积上样缓冲液，125 V 电泳 6 h;常规 AgNO3 染色52.5 CE SSCP 和 CE RFLP 检测参考文献[6]的方法涂层毛细管柱， λex=488 nm， λem=520 nm 荧光检测，P/ACE System station 数据处理软件采集数据。

变性处理与酶切样品 22 μL 分别加入 5 μL TBE，3 μL SYBR GreenⅠ，混匀后负极电动进样采用实验室已确定的PEO 分离 pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ)DNA Marker 最佳条件，对肺癌 p53 基因的突变情况进行检测3 结果与讨论3.1 最佳分离条件CE 分离 pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ)DNA Marker 的最佳条件[8]： 3.0%PEO，pH 8.2，电压 15 kV，温度 15 ℃由图 1可见，所有 DNA 片段基本得到基线分离，电泳在 15 min 内完成，分离效果好，时间短3.2 PCR 扩增结果1.5%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物，目的片段长度为124 bp由图 2 可见目的片段扩增成功6图 1 毛细管电泳分离 pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ) DNA Marker 结果Fig.1 Result of pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ) DNA Marker separation by CE1. 26 bp; 2. 34 bp; 3. 67 bp; 4. 110, 111 bp; 5. 147 bp; 6. 190 bp; 7. 242 bp; 8. 331 bp; 9. 404 bp; 10. 489 bp; 11. 501 bp。

图 2 p53 基因第七外显子扩增结果Fig.2 Result of p53 gene exon 7 amplificationM. DL500TM DNA Marker; 1. 癌旁正常组织(Normal tissue), 2，3. 肺癌组织(Lung cancer tissue)3.3 PAGE SSCP 结果双链 PCR 产物发生变性，与正常对照组相比，PAGE 可得到3 种异常迁移带型： 两条单链带皆发生迁移、多出一条或多出两条单链带，这些都是异常的单链 DNA(ss)迁移，由此可判断产物发生了碱基改变7对凝胶浓度进行考察：配制 8%、10%、12%和 15%的凝胶，浓度为 8%～12%时，电泳时间较短，约 5～7 h，但 DNA 双链(ds) 与ss，ss 与 ss 之间距离较近，不易区分; 浓度为 15%时，效果较好，电泳时间约 8 h本实验采用的凝胶浓度为 15%，结果如图 3 所示：由图 3 可见 2～5 均有异常条带迁移，所有样品中均有 dsDNA，以及癌旁正常组织变性得到的 ssDNA3.4 PAGE RFLP 结果突变常引起某一区域酶切位点消失，或产生新的酶切位点。

用适当的限制性内切酶进行酶切，突变基因产生与正常基因长度不同的片段可用于判断突变的发生PAGE RFLP 结果见图 4扩增产物经酶切后，癌旁正常组织得到 85 和 39 bp 两条片段; 肺癌组织为 124 bp 一条片段理论上 15%凝胶最小可分离 25 bp DNA 片段，但实验过程中癌旁正常组织 39 bp 这条小片段接近分离低限，PAGE 通常检测不到3.5 CE SSCP 结果PCR 反应剩余物质在紫外检测的 ds 之前会产生一些杂峰，采用荧光检测可消除杂峰干扰[8]，本实验采用荧光检测，结果见图85图 5a 为变性癌旁正常组织扩增样品，10 min 前一条未变性完全 ds，12.5 ～15.0 min 有两条 ss;图 5b 和 5c 为变性的具代表性肺癌组织，除有正常样品的 ds，ss 外，还具有异常 ss3.6 CE RFLP 结果癌旁正常组织和肺癌组织扩增产物酶切后进行 CE 检测(见图6)，10 min 内即可完成对于 PAGE RFLP 检测不出的 39 bp 这条小片段，CE 则能够清晰地检测到图 5 CE SSCP 结果Fig.5 Result of CE SSCPa. 癌旁正常组织(Normal tissue); b, c. 肺癌组织(Lung cancer tissue), 1. ds(Double strand); 2, 3. 癌旁正常组织变性后野生型 ss(Denaturated wild type single strand of normal tissue);4, 5. 肺癌组织变性后突变型异常 ss(Denaturated mutant type single strand of lung cancer tissue)。

图 6 CE RFLP 结果9Fig.6 Result of CE RFLPa. 癌旁正常组织(Normal tissue); b. 肺癌组织(Lung cancer tissue)3.7 4 种检测方法的比较根据以上实验结果，从上样量、时间、检出限及检出率 4 个方面对 4 种方法进行评价，结果见表 1检出率从高到低为：CE SSCP>PAGE SSCP>CE RFLP>PAGE RFLP40例癌旁正常组织中，4 种方法均未检测到基因突变以上结果可以看出，CE 各个方面都优于 PAGE 检测方法：完成一次电泳只需要几十分钟，结合荧光检测，无需染色过程节省大量时间，并且上样量为 nL 级，检出限与检出率比 PAGE 高，分析时间短、分辨率高、样品用量少、自动化程度高等优点对于临床检测基因突变十分重要表 1 检测方法比较Table 1 Comparison of detection methodsPAGESSCPRELPCESSCPRFLP 上样量 Sample volume3～5 μL3～5 μLnLnL 时间 Time 样品处理 Sample treatment20 min～90 min20 min～90 min 检测过程 Detection 10process～7 h～7 h～30 min～30 min 总耗时 Total time consuming～8 h～9 h～1 h～2 h 检出限 Detection limit[10～11]1 ng1 ng10-12 mol/L10-12 mol/L 检出率Detection rate(%)癌旁正常组织 Normal tissue0(0/40)0(0/40)0(0/40)0(0/40)肺癌组织 Lung cancer tissue27.5(11/40)12.5(5/40)35.0(14/40)17.5(7/40) CE SSCP 与 CE RFLP 相比，在肺癌组织 p53 基因突变检测方面，检出率分别为 35.0%(14/40)和 17.5%(7/40)，CE SS。