酪蛋白提取及定量测定.docx

实验 酪蛋白提取及定量测定摘要本实验通过调节pH至酪蛋白等电点的方法，从蒙牛牛乳中提取酪蛋白并计算得率， 然后分别用双缩脲和考马斯亮蓝G250染色法测定提取出的物质中酪蛋白的含量，实验的结 果将在下文陈述出来因为提取出的酪蛋白不太纯，所以导致后面的定量测试中有一定的误 差，这是要注意的材料与方法蒙牛牛乳酪蛋白的提取试剂的配制1 0.2 mol/L乙酸钠缓冲液（4.6）：准确称量1.15ml的乙酸，用氢氧化钠调至pH为4.6， 加水定容至1000ml2 95%乙醇3乙醚4乙醇-乙醚混合液：取乙醇，乙醚各30ml按1： 1的比例混合5 1%氢氧化钠：取0.1g氢氧化钠溶于10ml去离子水中方法取新鲜蒙牛牛乳100ml，放入250ml烧杯中，加热至40°C.加入100ml加热至同样温度的 醋酸缓冲液，边加边摇动，并用pH计检测，调整混合液的pH4.6（用1%氢氧化钠溶液或10% 醋酸溶液进行调整），冷却至室温，静置5min，然后用细沙布或滤纸过滤，收集沉淀物将 沉淀物用少量蒸馏水洗几次，过滤将洗净的沉淀物悬浮在约30ml 95%乙醇溶液中，用布 氏漏斗抽滤所得沉淀物用无水乙醇和乙醚等量混合液洗涤两次，抽干。

最后用50ml乙醚 洗一次并抽干取出抽干的粉状物，摊开在表面皿上，使乙醚完全挥发，干燥后得到的是酪 蛋白纯品准确称重并计算其产量酪蛋白的得率=测得含量/理论含量*100% （理论含量为35g/L）结果提取出的酪蛋白净重为32.2g，为白色粉末状，中夹杂黄色块状物体酪蛋白得率为 92%酪蛋白的测定双缩服法试剂配制（1） 酪蛋白溶液：5mg/mL，用0.1mol/LNaOH溶液配制；（2） 双缩脲试剂:称取1.5gCuSO4和6.og酒石酸钾钠，溶于500mL水中，在搅拌下加入 10%NaOH溶液300mL，用水稀释至1000mL，用棕色瓶避光保存方法1制作标准曲线取6只干燥试管编号，按下表加入下列试剂试管号 试剂123456样品1样品2标准酪蛋白溶液（ml）0.0000.4000.8001.2001.6002.000蒸馏水（ml）2.0001.6001.2000.8000.4000.000双缩脲试剂(ml)4.0004.0004.0004.0004.0004.000蛋白质含量(mg/ 管)0.0002.0004.0006.0008.00010.000OD0.0000.2320.4440.6180.8390.9830.5930.720将各管混匀后，在室温(15〜25°C)下放置30min，在波长540nn处比色，已1号管调零点 测定各管吸光度，一吸光度为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制标准曲线。

2样品测定酪蛋白样品必须进行调整，是2ml中含有1〜10mg酪蛋白，才能进行测定取 两只试管，分别吸取2.00ml样品稀释液，然后加入4.0ml双缩脲试剂，在15〜25C下放置 30min，已1号管调零测定吸光度，对照标准曲线，求出样品的蛋白质浓度，然后按照西式 倍数计算酪蛋白百分含量从上标准曲线及样品所测得的OD值可得样品的含量为6.390mg/<考马斯亮蓝法试剂配制(1) 牛血清蛋白(2) 85%的磷酸3) 95%乙醇溶液4) 蛋白质标准溶液：称取100mg牛血清蛋白，溶于去离子水中，定容至100mL， 即为1000ug/mL的原液5) 考马斯亮蓝G250蛋白试剂;称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50mL95%乙醇中， 加入85%的磷酸100mL，最后用去离子水定容到100mL方法标准曲线的绘制按下表分别加入各试剂管号试剂 -123456样品1样品21000ug/ml牛血清0.00.20.40.60.81.0蛋白溶液蒸馏水（ml）1.00.80.60.40.20.0蛋白质浓度（ug/ml）02004006008001000OD0.0000.8481.1391.2451.2591.2831.2581.228分别放入10ml具塞试管中，再加入5ml考马斯亮蓝G250蛋白试剂，盖塞，将试管中溶液 纵向倒转混合，放置2min后用1cm光径的比色杯在595nm下比色，以吸光度为纵坐标， 蛋白质浓度为横坐标，作出标准曲线。

样品蛋白质浓度的测定吸取样品稀释液1ml放入具塞刻度试管中，加入5ml考马斯亮蓝 G250蛋白试剂，从分混合，放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录吸光度 值，并通过标准曲线查的每毫升溶液中蛋白质的含量，以蒸馏水作空白样品 结果的计算样品蛋白质含量（ug/g，鲜重）=c*离心后的体积（ml）/样品鲜重（g） 式中c为在标准 曲线上查得的蛋白质浓度（ug/ml）实验分析1酪蛋白提取的原理是，蛋白质在其等电点pH溶解度最低，使酪蛋白析出沉淀2因为酪蛋白不溶于有机溶剂，而有机溶剂又可以溶解其他的脂类、蛋白质，所以可以用有 机溶剂洗涤酪蛋白的沉淀3选择未知样品的用量，取样量取决于样品总体数量和本身的均匀性，以及实验所需的用量，要确保 够用4作为标准的蛋白质应该性质比较稳定，所绘制出来的曲线范围大于样品范围5乙醇-乙醚混合液要即配即用，不然会挥发得很厉害6由于抽滤的速度过快，导致有样品跟洗涤液一起流入了滤液中7双缩脲与考马斯亮蓝都是作为显色剂，这样才能在可见光的范围内测出OD值。