微生物代谢调节.ppt

单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,,,*,3 微生物代谢调节,1,,本章内容：,第一节,,基本代谢的调节,,第二节,,次级代谢的调节,,第三节,,代谢工程,2,,第一节 基本代谢的调节,3,,微生物的代谢控制特征：,,①、高效利用养分的能力,,②、快速响应环境变化的能力原因：,通过快速启动或关闭,Pr,的合成和有关的代谢途径，平衡各代谢物流和反应速率来适应外界环境的变化4,,代谢控制机制：,,①、酶活调节,(,活化或钝化,),,②、酶合成调节,(,诱导或阻遏,),5,,Pr合成水平调节一般比酶活调节更为经济，后者快速，但浪费能量和建筑单位调节步骤主要存在于转录和转译的启动部位多步生物合成或分解代谢途径中其关键部位酶活的快速调节主要靠变构控制机制为避免前体代谢物和建筑材料过量生成，M细胞必需协调组成代谢和分解代谢必需协调(例如，同步地)大分子（如核酸Pr或膜）的形成，以便在胞内外环境条件变化期间细胞还能生长好此外，还需尽可能微调透过各种代谢途径的碳流，以避开代谢瓶颈或不需要的反应常需消除这些调节机制，使所需代谢产物能过量生产。

6,,M初级代谢调节方式：,酶活调节,,酶合成调节,,遗传控制,7,,3.1.1.1 代谢调节的部位,,,M代谢调节部位,：养分吸收排泄、限制基质与酶接近、控制代谢流（图3-1）真核生物与原核生物区别,：前者有细胞器3.1.1 酶活性的调节,8,,图3-1,原核生物代谢调节部位,9,,图3-1,真核生物代谢调节部位,10,,（1）养分吸收分泌的通道,,大多数亲水分子难于透过细胞膜，需酶系统（如透酶），某些运输反应需要能量代谢调节的部位,:,,11,,（2）限制基质与酶接近,,,真核生物,：各种代谢库的基质分别存在于细胞器内例如：链孢霉中精氨酸存在于细胞质和液泡内这两处参与精氨酸代谢的酶量有很大差别原核生物,：有些酶以多酶复合物存在或与细胞膜结合，类似于酶固定化，不能自由活动12,,M控制代谢物流的方法,：,,调节酶量,—,增加或减少途径中有关酶的合成或降解速率；,,改变酶活性,—,通过小分子化合物调节酶反应速率，激活或抑制，有效地控制各种代谢过程酶活性调节包括,：共价修饰、变（别）构效应、缔合与解离、竞争性抑制3）代谢途径的通量扩展,13,,共价修饰：,Pr分子中一个或多个AA残基与一化学基团共价连接或解开，使其活性改变的作用。

共价修饰可使酶钝化或活化化学基团,：磷酸基，甲基，乙基，腺苷酰基,,,Pr的共价结合部位,：一般为丝氨酸残基的-CH,2,OH共价修饰作用分类：,可逆的和不可逆3.1.1.2 共价修饰,14,,,有些酶存在活性和非活性两种状态，可通过共价修饰而互相转换,.,,,（1）可逆共价修饰,15,,例1：磷酸化可改变真核生物中磷酸果糖激酶或蛋白激酶的活性粗糙链孢霉的糖原磷酸化酶以磷酸化形式存在，无5’-AMP时具有完全活性；其去磷酸化需要5’-AMP才显示其活性这两种形式可藉特殊的激酶和磷酸酯酶互相转换某些具有两种组分调节系统的调节蛋白也受磷酸化激活例2:,大肠杆菌谷氨酰胺合成酶活性即通过,腺苷酰化,调节16,,可逆共价修饰作用的意义,：,,①、可在短时间内改变酶活性，有效地控制细胞的生理代谢；,,②、这种作用更易为响应环境变化而控制酶的活性17,,典型例子是,酶原激活,酶原被相应的蛋白酶切去一小段肽链而被激活例1、,胰蛋白酶原,的活化从,N,-端除去一个己肽,(Val-Asp-Asp-Asp-Asp-lys),胰蛋白酶原活化是信号放大的一个典型例子,因胰蛋白酶具有自身催化作用，少量肠肽酶可激发大量胰蛋白酶原转变成胰蛋白酶。

这些胰酶完成了其使命后，便被降解这种酶活性的关闭作用是极其重要的2）不可逆共价修饰,18,,除受某些反应基质和产物的直接影响外，许多酶还受一些,效应物,的控制这些,效应物,是一种酶的基质、产物或调节性代谢物效应物,促进或抑制酶的反应速率，影响酶对基质的亲和力效应物结合在酶的某一位点会影响另一配基对第二个位点的结合，这种可逆的相互作用机制称为,变构活化或变构抑制,前体的活化,和,反馈抑制,是常见的机制3.1.1.3 变（别）构控制,19,,变构酶通常是具有多个结合位点的寡聚蛋白效应物和基质结合位点的占据会影响亚单位间构象的相互作用，导致基质亲和力的变化20,,图3-2 酶活的变构调节,结合位点间的正向协同作用导致基质浓度对反应速率的影响呈S型(图3-2)21,,,变构酶,：以两种构象形式存在，活性（a）态和钝化（b）态正效应物,的结合将增加酶的a态部分，而,负效应物,的结合会使平衡移向b态加入正效应物会使曲线向左移，因而消除了正向协同作用，使曲线符合米-孟动力学模型；负效应物增加协同现象22,,在代谢途径的支点和代谢可逆步骤(如供、需ATP步骤)中常发现变构控制酶，如在酵解、糖原异生和TCA中（图3-3）。

23,,酵解、糖原异生可在细胞内同时进行小的配基，如AMP，NAD，ADP，F-1,6-BP，AcCoA等可作为变构效应物在葡萄糖分解代谢中AMP，ADP，ATP或NADH的浓度反映细胞能量或氧化还原变化的现状故过量ATP会减缓能量代谢，而高浓度ADP和AMP会促进能量代谢24,,变构调节机制可归纳为以下几点：,,①、,天冬氨酸转氨甲酰酶,是具代表性的一类变构酶有一个以上的结合位点除了结合底物的活性中心外，在同一分子内还有一些分立的效应物结合位点；,,②、主要位点和副位点可同时被占据；,,③、副位点可结合不同的效应物，产生不同的效应；,,④、效应物在副位点上的结合可引起Pr分子构象变化，影响酶活性中心的催化活性；,,⑤、变构效应是反馈抑制的理论基础，是调节代谢的有效方法25,,（1）缔合与解离,,进行这种转变的,Pr,由多个亚基组成Pr,活化与钝化通过亚基的缔合与解离实现这类互相转变有时由共价修饰或若干配基的缔合启动3.1.1.4 其他调节方式,26,,（2）竞争性抑制,,一些Pr的生物活性受代谢物的竞争性抑制例如，需要NAD,＋,的反应可能受NADH的竞争抑制；需ATP的反应可能受ADP或AMP的竞争性抑制；有些酶受反应过程产物的竞争性抑制。

27,,3.1.2.1 诱导作用,,,诱导酶,：,培养基中某种基质的存在会增加,（,诱导,）,细胞中相应酶的合成速率能引起诱导作用的化合物称为,诱导物,（inducer）,，可以是基质、基质衍生物，或产物组成型酶：,如酶的合成速率受基质浓度变化的影响很小，称,组成型酶,3.1.2 酶合成的调节,28,,,诱导动力学定量,：测定在各种适当生长条件下培养物的酶比活（U/mg Pr），或采用Monod微分方程作图表示在恒定环境中平衡生长（分批培养对数生长早期或连续培养）期间，细胞Pr以一定的比例合成29,,酶的微分合成速率,：酶占总的新合成Pr的分数为了获得微分曲线，在分批生长期间间歇取样，测定酶活的Pr含量只要培养条件恒定，通常能获得一直线，其斜率代表合成的微分速率到对数生长末期，随培养基中代谢物的积累，曲线会偏离直线30,,在生长期间加入一种能诱导酶的化合物—异丙基-,β,-D-硫代半乳糖苷（IPTG），作图会显示出两条直线，分别代表有和没有诱导物的合成速率图3-4显示一种安慰诱导物对大肠杆菌,β,-半乳糖苷酶的诱导作用31,,32,,试验是在最低盐分-麦芽糖培养基中进行过程添加的ITPG最终浓度为10-4mol/L。

有诱导物IPTG时，β-半乳糖苷酶的比活为104U/mg Pr；无诱导物时为10U/mg Pr（图中虚线）—将培养物过滤后重新培养在不含IPTG的培养基中的结果33,,安慰诱导物：,,,β-半乳糖苷酶能水解乳糖成葡萄糖和半乳糖有些诱导物不被代谢，被称为,安慰诱导物,（gratuitors）,，如异丙基硫-β-半乳糖苷，,IPTG,诱导系数：,,,酶合成的诱导速率与非诱导速率之比称为,诱导系数,ITPG,的诱导系数为,1000,34,,指培养基中某种基质的存在会减少（阻遏）细胞中相应酶的合成速率阻遏物（repressor）,在分解代谢中是操纵子调节基因（R）编码的阻遏蛋白，能可逆地同操纵基因（O）结合，从而控制其相邻的结构基因（S）的转录3.1.2.2 分解代谢物阻遏,35,,能被快速利用的基质，如葡萄糖，其分解代谢物会阻遏另一种异化较难利用基质的酶的合成图3-5,为大肠杆菌K12中精氨酸对鸟氨酸氨甲酰基转移酶合成的阻遏作用后者参与精氨酸的生物合成精氨酸加入到培养物中，其合成速率很快受到阻遏；精氨酸去除，阻遏作用很快被解除（derepression）阻遏率：,合成的阻遏速率与去阻遏速率之比称为,阻遏率,。

36,,37,,试验在最低盐分-麦芽糖培养基中进行添加精氨酸时，鸟氨酸氨甲酰基转移酶的比活为1.5U/mg Pr-图中实线；除去精氨酸的后比活为1200U/ mg Pr-图中虚线，是将培养物过滤后重新培养在不含精氨酸的培养基中的结果38,,AA，嘌呤和嘧啶核苷酸生物合成的控制以,反馈调节,方式进行其生理意义,在于避免物流的浪费和不需要酶的合成反馈抑制一般针对紧接代谢途径支点后的酶；而阻遏往往影响从支点到终点的酶3.1.2.3 反馈调节,39,,操纵子编码的阻遏Pr无活性，需与,辅阻遏物,（co-repressor，即终产物或其衍生物）,结合才能阻止编码合成途径中的第一个酶的基因转录图3-6为简单支路途径的调节方式1）反馈阻遏,40,,41,,,肠道细菌可能具有两种同功酶催化A→B的反应，其一由E控制；其二由G控制酶2的阻遏通常属于协同作用顺序反馈抑制，首先在枯草杆菌芳香氨基酸系统中发现如图3-6所示，E抑制酶3和G抑制酶5，从而积累C，C再抑制酶142,,反馈抑制的补偿拮抗作用可举大肠杆菌氨甲酰磷酸合酶的例子其产物，氨甲酰磷酸用于Arg和嘧啶的合成其合酶受UMP抑制，此抑制作用受鸟氨酸拮抗，后者可以与氨甲酰磷酸反应产生瓜氨酸。

图3-6中的H拮抗G对酶1的抑制作用43,,图3-7a.为枯草杆菌和地衣杆菌的分支酸形成途径调节方式枯草杆菌具有两种明显不同的莽草酸激酶(s)和两个分支酸变位酶(c) ；地衣杆菌有两个s酶，一个c酶枯草杆菌的s同功酶之一像酶p（磷酸-2-酮-3-脱氧景天庚酮糖酸醛缩酶）那样受分支酸或预苯酸的抑制；地衣杆菌的s酶只受分支酸的抑制枯草杆菌中p、s和c的活性受酪氨酸的阻遏；而地衣杆菌中的酶s是组成型的，酪氨酸阻遏p和c的活性44,,45,,46,,不同细菌属的酶p受阻遏方式不同芽孢杆菌属中的顺序反馈抑制作用也存在于链球菌中链霉菌中色氨酸是惟一的抑制剂假单孢菌属中酪氨酸是主要抑制剂要最大限度地抑制需苯丙酮酸(苯丙氨酸的直接前体)和酪氨酸的联合作用，色氨酸只产生部分抑制作用酪氨酸和色氨酸的抑制作用可被PEP克服；而苯丙酮酸的抑制作用则被D-赤藓糖-4-磷酸所克服即如途径起始材料不足，产率受终产物反馈抑制的影响特别显著47,,图3-7b,为枯草杆菌和绿脓杆菌的色氨酸合成末端途径的调节枯草杆菌与肠道杆菌调节方式相似，第一个酶，,邻氨基苯甲酸合酶,a受色氨酸抑制a和其他酶还受色氨酸的反馈阻遏48,,49,,对假单孢菌，a受色氨酸阻遏，但酶合成的调节方式不同：a，o（,邻氨基苯甲酸核糖基转移酶,）和I（,吲,哚甘油磷酸合酶,）受色氨酸阻遏，r（,磷酸核糖基-邻氨基苯甲酸异构酶,）是组成型。

其色氨酸合酶复合物t受其基质茚哚甘油磷酸的诱导这些酶合成控制的差异也反映在相应基因的定位上在枯草杆菌中这些基因如同在肠道杆菌那样形成一簇，而在绿脓杆菌和,Ps．putida,中酶a，o和i的基因构成一簇，色氨酸合酶两个组分的基因构成另一簇，酶r的基因单独存在50,,是一种常用于组成代谢的负向变构控制在大肠杆菌色氨酸抑制其自身生物合成中的第一步，即催化赤藓糖-,4,-,P,与,PEP,缩合的同功酶；其他同功酶则分别受苯丙氨酸和酪氨酸的调节（图,3-8）,终产物的反馈控制使细胞能保持某一代谢物适当的浓度代谢途径分支点处的酶分别受不同终产物的调节2）反馈抑制,51,,52,,53,,,代谢途径中酶的诱导和阻遏常常是平行的例如：,负责乳糖分解代谢的酶在合成速率方面显示出协同控制作用，即其合成速率在所有生长条件下均以恒定的比例进行当,β-半乳糖苷酶,被诱导时，其他两种Pr，,半乳糖苷透酶和β-半乳糖苷转乙基酶,也同时被诱导出来前者负责乳糖和其他有关物质，如硫-β-D半乳糖苷运输到细胞内，后者生理作用不明再例如,：大肠杆菌K12中精氨酸同时阻遏鸟氨酸氨甲酰基转移酶和精氨酸合成中的其他几种酶这一现象有时称为,调节子,(regulon)。

3.1.2.4 协调控制,54,,,精氨酸生物合成酶中有些显示协同控制作用，有些没有,如：将细胞从含有精氨酸的培养基移种到缺少它的培养基中，,鸟氨酸氨甲酰基转移酶,去阻遏达100倍，其他酶去阻遏约10倍原因：,一种可能的解释是,鸟氨酸氨甲酰基转移酶,与,天冬氨酸氨甲酰基转移酶,（从酶催化嘧啶合成的第一步）竞争同一基质，氨甲酰磷酸为此，在胞内低精氨酸浓度下需确保有足够的氨甲酰磷酸流向精氨酸合成途径反之也一样，在缺少尿嘧啶或胞嘧啶下天冬氨酸氨甲酰基转移酶的去阻遏的程度比其他嘧啶生物合成酶更大55,,在一途径中胞内不同酶的含量是变化的代谢途径可分为两种极端类型：,通道型,；,库存型,3.1.3 代谢系统的分子控制机制3.1.3.1 遗传控制,56,,,通道型,途径中某些中间体保持与Pr结合状态（局域化），有时组成超大分子的多酶结构，催化某一代谢的连续步骤这些中间体不能与中间体库自由交换库存型,途径中所有中间体可以自由交换（扩散），它们在细胞内不与Pr结合因此，一种代谢物既可作为一种酶的基质又可作为效应物代谢控制理论运用库存型代谢方式以数学模型（微分方程）描述代谢物流和代谢途径的控制步骤。

57,,细胞中的遗传物质总称为,基因组,，由DNA构成，编码了细胞该如何运行的指示每一种酶或多肽的合成分别由基因或遗传信息顺序（大约含600碱基对）调节若M的基因组里不存在某一种酶的基因，该M不能合成相应的酶不是所有基因都是结构基因有些基因产物具有调节功能，是一种能抑制或促进一些代谢过程的Pr58,,M酶合成的调节主要发生在转录阶段（RNA聚合酶结合到DNA上）或转译起始阶段图3-9,显示细菌中酶合成期间的可能调节位点许多细菌的基因在不同生长条件下以稳定的速率转录，其中一些参与中枢代谢途径的酵解酶类被称为,管家酶,59,,60,,61,,在大肠杆菌中其转录始于RNA聚合酶复合物（RPC）与启动子DNA序列（位于基因的上游）结合，形成一关闭的DNA复合物，由此形成RPC,（图3-10）,负责转录管家基因的RPC具有一亚单位，σ,70,（上标代表蛋白质的相对分子质量），由它决定启动子区域和开始DNA的转录为mRNA在RPC沿着DNA移动过程中σ,70,被释放，由一种外来的蛋白NusA取代这时两股DNA打开成为开放复合物，由此启动DNA转录转录期间NusA一直与RNA聚合酶在一起，直到遇到DNA转录中止结构整个基因转录完毕。

RNA聚合酶与NusA蛋白解离，又可重新进入新一轮的转录62,,63,,RNA聚合酶复合物（RPC）含有2个α、1个β和1个β’亚单位以及σ,70,因子外来蛋白NusA在开放复合物位置上替代σ,70,，并留在RPC上，直到遇到DNA脂质结构RPC从DNA处解离，开始新一轮转录作为调节性组分的σ因子在大肠杆菌中DNA的识别是由RPC亚单位，σ,70,控制的，后者引导RNA聚合酶结合到启动子上对距转录起点上游10～35bp的距离(-10～-35盒)处，σ,70,亚单位对两盒DNA的6～8bp是专一性的64,,σ,70,启动子主要由碱基A或T组成在-10与-35盒之间被一16～18个碱基对组成的干涉DNA分开大肠杆菌还存在另外一些σ因子，σ,32,、σ,43,、σ,54,(分别具有32 000，43 000和54 000相对分子质量)枯草杆菌，链霉菌等的专一性启动子区域的特征与σ,70,启动子同感区域有所不同这些σ因子每个控制多组基因(一组多到50个)，它们只在一定的环境条件(如N-限制，热冲击，孢子形成，氧应激等)下被转录这些σ因子本身的形成受严密调节和对不同环境做出响应65,,细菌中，,DNA,结合,Pr,与,位于基因前头的,DNA,区域,相互作用。

这些,Pr,通过,干扰,RNA,聚合酶，,允许或阻止下游序列的转录那些能让,RNA,聚合酶与,DNA,更紧密结合（专一）的,Pr,称为,激活剂,（正向调节）；,,而那些在早期阻止转录的称为,阻遏物,（负向调节）,（图,3-9,）3.1.3.2 DNA结合蛋白：激活剂与阻遏物,66,,67,,,为了取得充分的DNA结合活性，这些Pr往往依赖于小的效应物分子例如：,肠道细菌中,cAMP,与,cAMP,受体,Pr（CAP）,结合形成一复合物此复合物可结合到,DNA,的专一性位点，促进,RNA,聚合酶的结合和转录（,=,活化）例如：,色氨酸可作为一种辅阻遏物，它能改变,TrpR,阻遏物分子，使其变成活性形式，阻遏,TrpR,基因的转录68,,分解代谢途径中的,阻遏物分子,可被,诱导物分子,（通常是基质或其衍生物）钝化,,,例如：,lac,基因中的乳糖乳糖分解代谢酶的合成受乳糖的诱导某些情况下同一,Pr,分子,既可作为激活剂，又可作为阻遏物,，这取决于其基质和它所结合的,DNA,区域例如,:,肠道细菌的,L-,阿拉伯糖利用系统是这方面的典型例子69,,细菌的二元调节系统含有两种,Pr ：,传感器,（发射器），,调节器,（接收器）。

传感器分子,是跨膜,Pr，,起,Pr,激酶,作用，能催化,需,ATP,的自动磷酸化作用,和,将磷酸基转移给其他,Pr,的作用（如调节器）受外界或内部刺激,(,如渗透压、化学吸引剂、特殊分子存在或缺乏,),，,传感器分子,便自动磷酸化，把刺激转换成生化信号,（传感器分子磷酸化状态）,此信号可通过磷酸基的转移将信号传给,可溶性调节器,Pr,（,图3-11,）,磷酸化调节器,可作为转录的激活剂或阻遏物再与,DNA,序列相互作用此二元系统是,M,中的信号传导模型，参与,硫酸盐代谢,和,氮代谢,的调节3.1.3.3 二元调节系统,70,,71,,一旦形成转录本,mRNA，,仍然有方法控制此转录本的转译一种称为,衰减器模型（,attenuator model）,是在,mRNA,水平调节上起作用的它是在研究大肠杆菌的嘧啶和几种,AA（,组氨酸，苯丙氨酸，色氨酸）的生物合成中发现的特征,：,mRNA,含有一引导区域（在第一个结构基因的上游部分），显示出一种,不平常,AA,密码子的堆积,3.1.3.4 RNA水平的调节机制：衰减器模型,72,,图,3-12,为大肠杆菌色氨酸调节衰减器模型两个,Trp,密码子,相邻地位于引导区，通常很少看见,Pr,编码有,Trp,密码子。

衰减器模型能区分以下两种情况：,,①、细胞含有丰富,AA,,②、,细胞缺乏某种,AA色氨酸衰减器模型,73,,细胞含有大量携带,Trp,的,tRNA,，,迅速形成引导肽在,trp,mRNA,上工作的核糖体复合物,与,合成,trp,mRNA,的,RNA,聚合酶,同步运行由此，第一个可能的,mRNA,次级结构，,干环,(,stem loops),构型形成一种,中止环,(1：2),，加上一,终止区环,(3：4),，见,图,3-12,如出现这种情况，,RNA,聚合酶复合物十有八九会停止在终止区环上并解离随后结构基因转录终止当色氨酸丰富时：,74,,75,,缺少负荷的,tRNA,trp,，,trp,引导区的转译被停止，核糖体便停顿在,Trp,密码子上，并阻止中止环的形成其结果形成一种,抗终止区环,（,2,：,3,）,，,从而抑制终止区环的形成RNA,聚合酶继续转录,trp,基因当色氨酸缺乏时：,76,,。