贝类体内麻痹性贝类毒素的提取方法研究.doc

摘要】 采用浓度系列为 0.04、0.07、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50、0.70、OOmol/L的HCI和HAc溶液作为提取液,分别取10 mL提取液与10 g栉孔 扇贝性腺混合，在沸水浴中加热5 min提取麻痹性贝类毒素(PSP)；同时采用0.3 mol/L HAc和0.2mol/LHCI,于冰水浴中进行超声波提取麻痹性贝类毒素5〜30 min提取完成 后将混合物于4 C冷冻离心机内离心5 min (3500 r/min),取上清液并以0.1 mol/L NaOH或5 mol/L HCI调整至pH为2.0〜4.0经超滤膜过滤后的提取液以高效液相色谱柱 后衍生荧光检测法进行毒素分析，研究毒素组分间的转化关系和提取效率，并与超声波提 取法进行了比较结果表明，采用0.04-0.25 mol/L HCI和0.04〜1.0 mol/L HAc从贝肉 中提取PSP毒素，各毒素组分浓度差异不大，当HCI浓度大于0.25 mol/L时，N磺酰氨 甲酰基类毒素C1浓度急剧降低，HCI浓度大于0.5 mol/L时，N磺酰氨甲酰基类毒素C2 和GTX5浓度急剧降低，三者在酸度过大的情况下分解或转化为膝沟藻毒素2 (GTX2), 膝沟藻毒素 3 (GTX3)和石房蛤毒素(STX) o在相同浓度酸的情况下，超声波提取 液中C1毒素的浓度显著低于沸水浴提取法，但C2的浓度略高于沸水浴提取液。

关键词】麻痹性贝类毒素液相色谱检测提取方法Investigation of Extration Method for P analytic S hellfish Poisoning Toxins in S hellfishJIANG Tao, JIANG Tian Jiu1 (Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071)2(The Graduate School, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039)3(Department of Environmental Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632)4(College of Life Science and Technology, South China Normal University, Guangzhou 510631)Abstract The optimal conditions were established for the extraction of paralytic shellfish poisoning toxins from gonad of Chlamys nobilis using acetic acid and hydrochloric acid in the concentration range of 0.04 — 1.0 mol/L. A 10 g portion of gonad of Chlamys nobilis was extracted by boiling for 5 min with 10 mL acetic acid and hydrochloric acid in a 50 mL beaker, Meanwhile, a portion of gonad of Chlamys nobilis was extracted by sonication in the solution of 0.3 mol/L HAc+0.2 mol/L HCI for a total period of 5—30 min. The raw extract was centrifuged at 3500 r / min for 5 min and the pH of supernatant was adjusted from 2.0 to 4.0 by 0.1 mol/L NaOH or 5 mol/L HCI. After passing through a Millipore ultrafiltration membrane (10000 MW cut off), ultrafiltrate was then analyzed by HPLC. The results showed that hydrochloric acid in the concentration range of 0.25—1.0 mol/L caused a significant decrease of N sulfocarbamoyl 1 1 hydroxysulfate toxin C1 (C1), C2 and gonyautoxin 5(GTX5) and the concomitant increase of GTX2,3. However, the amount of the three unstable toxins did not show any change using the extraction with acetic acid. Under the same concentration of acetic acid (0.3 mol/L) and hydrochloric acid(0.2 mol/L), the amount of C1 in the ultrasonic extraction was obviously lower than the boiling one, while C2 showed slightly higher than the latter.Keywords Paralytic shellfish poisoning toxins, high performance liquid chromatography, extraction本文系国家863项目(NO.2006AA092163) , NSFC 广东联合基金项目 (NO.U0733006)和国家海洋公益性行业科研专项(No.2008418100)联合资助* E mail: tjiangtj@1引言麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poisoning toxins, PSP)是一•类对人体神经系统 产生麻痹作用的海洋生物毒素，主要由有毒甲藻产生，可通过食物链在贝类等生物体内累 积放大[1]。

当人们误食这些染毒的海产品时，就会发生中毒或死亡PSP是一类四氢喋吟 的衍生物，现已发现该类毒素有20余种成分，分为四类：氨基甲酸酯类毒素(Carbamate toxins),包括石房蛤毒素(Saxitoxin, STX),新石房蛤毒素(Neosaxitoxin, NEO),膝沟藻毒 素(Gonyautoxin),包括膝沟藻毒素GTX1 ,GTX2,GTX3和GTX4； N 磺酰氨甲酰基类 毒素(N sulfocarbamoyl toxins),包括 C1、C2、C3、C4、GTX5(B1)和 GTX6(B2)；脱氨 甲酰基类毒素(Decarbamoyl toxins),包括 Decarbamoyl saxitoxin (dcSTX), Decarbamoyl neosaxitoxin (dcneoSTX), Decarbamoyl gonyautoxins 1 4 (dcGTXI 4):脱氧脱氨甲 酰基类毒素(Deoxydecarbamoyl toxins)o PSP对人体毒性极强，且无特效解救药物，在我 国沿海分布广泛，已发生多起由该类毒素造成的人员中毒死亡事件，受到人们的高度关注 [2-4],是我国相关海产品食用安全的必检项目。

国际上从贝类中提取PSP的方法主要有AOAC方法[5],但由于N 磺酰氨甲酰基类 毒素(C1、C2、B1、B2等)在强酸性条件下化学性质不稳定，易于转化，所以该法在提 取条件上尚存在争议目前，从贝类中提取PSP的方法比较方面研究较少，诸多研究者提 取方法各异[3, 6〜10],因而其结果难以进行比较有鉴于此，本实验采用不同浓度的HCI 和HAc溶液作为提取液，探索了不同条件下贝类中PSP的提取效率和各成分的变化，以 期能够确定最佳的提取条件，为PSP的研究和监测提供参考2实验部分2.1仪器、试剂与材料高效液相色谱系统，主要由Agilent1100系列组成；柱后衍生系统采用Pickering Laboratories PCX5200,衍生温度75 C；荧光检测器为Agilent G1321A,激发波长330 nm,发射波长390 nm用于毒素分离的C8反相柱(150 mmx 4 . 6 mm, 5 pm, GL Science公司)，柱温35 C其它仪器包括：超声波清洗器(HB3120U,汉邦科技公司)； 水浴锅（上海圣欣科学仪器有限公司）；精密电子天平（Mettler Toledo公司）；高速离心 机（Sigma 2 16K,美国）。

用于毒素提取和分析所需的试剂均为色谱纯或分析纯乙腊为色谱纯（美国TEDIA公 司），分析采用的离子对试剂庚基磺酸钠（日本东京化成工业株式会社（TCI Ace））,四丁 基磷酸铉（SIGMA公司）实验用水均为经Millipore超纯水系统生产的超纯水标准毒素部 分购自加拿大海洋生物研究所海洋分析化学标准组，包括GTX1 5、dcGTX2 3标准 毒素C1和C2由日本Oshima教授和香港科技大学谢显堂教授提供华贵栉孔扇贝（Chlamys nobilis）采自深圳大亚湾海域，样品采集后现场用水冲净外 壳，并用不锈钢刀打开，将贝肉、性腺和消化腺分离，用纱布吸除多余水分，然后冰块保 存运至实验室，一20 C贮存配制不同浓度的HCI和HAc溶液作为PSP提取液，浓度分别为0.04、0.07、0.10、 0.15、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50、0.70 和 1.0 mol/L2.2实验方法选择扇贝性腺作为实验对象（约1800g）,将其全部绞碎匀浆至组织均匀实验分为 4组，每组分为不同的实验水平，每个水平3个平行，结果取平均值组每平行称取性 腺约10 g,加入同等体积（mL）的不同浓度HCI充分搅拌并测其pH值，但不调整酸度； II组每平行称取性腺约10 g,加入同等体积（mL）的不同浓度的HAc充分搅拌测其pH 值，但不调整酸度。

I、II两组均沸水浴中加热5 min,然后迅速放入冰水浴中冷却，立 即于4 冷冻离心机内进行离心（3500 r/min, 5 min）取上清液，以0.1 mol/L NaOH或5 mol/L HCI调整pH为2.0〜4.0之间III、IV组分别称取性腺50 g,分别加入同等体积的 0.3 mol/L HAc和0.2 mol/L HCI,于冰水浴中进行超声波提取，同时用玻璃棒进行搅拌，分 别在5、10、15、20、25和30 min迅速取出约1 mL,于高速离心机内离心（12000 r/min, 3 min）以上4组样品离心后取上清液，经滤膜孔径为10,000 Da的超滤离心管 （Millipore 公司）4 C离心（12000 r/min, 10 min）后，取超滤液作 HPLC 分析2.3HPLC分析方法麻痹性贝毒的HPLC分析参照Oshima方法［11］并加以改进分析过程采用3次等梯 度洗脱第1次专门分析GTX和dcGTX类毒素，洗脱液为含有3.0 mmol/L庚烷磺酸钠 的10 mmol/L （NH4）3PO4缓冲液离子对试剂，pH 7.1；第2次专门分析STX类毒素，洗 脱液为含有2.0 mmol/L庚基磺酸钠的30 mmol/L （NH4）3PO4缓冲液。