苜蓿生物技术中研究(已发表).doc

苜蓿生物技术研究俞金蓉 玉永雄（西南大学牧草与草食家畜重点实验室，重庆 北碚 400716）摘要：苜蓿是世界上重要的豆科牧草，它具有品质优良易于栽培等特点在生态环境保护方面也发挥着积极作用，随着分子生物学和植物基因工程的发展，在分子水平上对苜蓿进行遗传改良的研究已取得了部分成果本文简单介绍了苜蓿组织培养的种类及影响因素，综述了近年来遗传转化和分子标记等生物技术在苜蓿研究领域的应用，并展望了苜蓿基因工程在今后研究工作中的重要地位和发展前景关键词：苜蓿；生物技术；研究进展Application of biological techniques in alfalfaYU Jin-rong, YU Yong-xiong(Southwest University, Forage & Herbivore Key Lab., Beibei Chongqing 400716)Abstract: As an important legume forage plant in the word, alfalfa possesses quite a fine quality of nutrition, easily to be planted ,and playing a positive role in improving natural environment. With the development of molecular biology and genetic engineering of the plant some achievements about genetic improve of alfalfa have been obtained on the molecular level .In this paper, some types and influence factors of alfalfa tissue culture were introduced briefly, application in the research field of the alfalfa, such as genetic transformation and molecular marking was summarized .Finally, we also looked forward to the important position and prospect of alfalfa genetic engineering in the research wok in the future..Keywords: Alfalfa; Biotechnology; Progress苜蓿（Medicago sativa） ，英文名 Alfalfa或Lucerne，为豆科，苜蓿属。

是世界上栽培最早，分布面积最广的优质豆科牧草之一全世界种植面积约3500万hm 2苜蓿在我国已有两千多年的栽培历史，全国各地都有种植，主要分布在西北和华北地区，种植面积约499万hm 2苜蓿中蛋白质含量约占总干物质量的17％－20％，与其它豆科牧草相比，其营养价值被列为各种牧草之首，又由于其高产、稳产、易栽培等特点，素有“牧草之王”的美誉，是一种极好的饲料作物尽管苜蓿优点甚多，但也存在种子细小、硬实率较高、产量低、花叶病危害大及反刍动物大量采食易得膨胀病等，这就给苜蓿产业化生产带来了许多不便，人们已充分认识到针对上述缺点对苜蓿加以改良的必要性 因此以常规育种为基础，借助于生物技术改良品质，培育优质、高产的新品种，不失为一种直接、有效的方式1972年，美国率先开始了对苜蓿花药和组织培养技术的研究与此同时，前苏联也进行了类似的研究，并进行百脉根、红三叶、红豆草的花药培养、组织培养和细胞培养技术的研究加拿大等国还研究了紫花苜蓿原生质体培养技术70年代末到80年代初，美国等又开始了牧草基因工程的研究，并取得了突破，1991年转基因苜蓿植株已移至田间种植我国牧草生物技术的研究是在70年代末开始起步的，一个重要标志是1979－1980年黑龙江畜牧研究所和中国农业科学院草原研究所分别运用花药培养获得了紫花苜蓿再生植株。

在发达国家，基因工程中的许多先进技术已被广泛应用于苜蓿研究的各项领域，并在苜蓿抗性育种、减少膨胀病危害、提高干物质消化率、品质改良等方面取得了进展和突破国内在上述方面的研究则起步较晚，与国外相比尚存在一定的差距1.苜蓿组织培养1972年,美国学者Saunders 和Bingham [1]从未成熟的苜蓿花药、子房、子叶愈伤组织分化再生植株成功，标志着苜蓿组织培养研究的开始，自此大量有关苜蓿组织培养的研究工作得以开展到目前为止，苜蓿的组织培养已经发展到许多种方法，并已建立起了成熟的再生体系常用的组培途径有愈伤组织培养、原生质体培养、细胞悬浮培养、茎尖分生组织培养、花药培养、合子胚培养等影响苜蓿组织培养效果的因素很多,据国内外关于苜蓿组织培养的报道,大致可分为如下几种: （1）品种基因型基因型在植株再生中的重要作用已得到许多学者的肯定已经证实，不同的苜蓿品种再生能力存在着遗传差异, 即使是再生能力较强的品种，在不同的再生体系中也会显示不同的结果 [2] 苜蓿愈伤组织的植株再生能力是高度遗传的，并可通过轮回选择的方法进一步提高再生能力 邓百万等 [3]认为，基因型杂合程度越高的品种，其胚胎形成能力越强，再生能力也越高。

2）外植体型苜蓿组织培养开展近30年来， 国内外研究报告中所采用的外植体种类繁多，几乎苜蓿所有的器官或组织都可作为外植体，如茎尖、叶片、茎段、幼芽、子叶、下胚轴、上胚轴、花药、花粉、子房、胚珠、叶柄等一般形成脱毒苗时常以茎尖作为外植体，可高度保持种性；形成胚性愈伤组织时可选用叶柄、子叶、上胚轴、下胚轴、幼芽等作为外植体，优点是：污染较小、材料易得、操作方便；快繁时可选用茎段、花茎、叶片、花序等作为外植体，操作简单、取材容易；单倍体选择则应选花药、花粉、胚珠、子房等作为外植体，但组织培养的难度较大3）培养基种类、激素浓度及配置组合苜蓿组织培养中最常用的培养基有如下4种：B 5、N 6、MS和SH多数报道为：以它们其中一种或两种为基本培养基，再辅加一些细胞生长调节物质，如NAA、IAA、2,4-D、6-BA、KT、ZT等，其中NAA、IAA、2,4-D属于植物细胞生长素类，在离体培养中主要诱导愈伤组织的形成和根的发育而6-BA、KT、ZT则属于细胞分裂素类，在培养基中加入细胞分裂素的目的，主要是为促进细胞分裂和由愈伤组织或器官上分化不定芽危晓薇等 [4]的研究发现，用SH 培养基的无机盐与MS培养基的有机成分对诱导苜蓿愈伤组织较合适。

另外在培养基中加入适量水解酪蛋白（CH） 、肌醇对愈伤组织的健康生长和芽丛分化也都有促进作用肖荷霞等 [5] 报道不同外植体来源的愈伤组织生长以及降低褐化所需的激素种类和浓度不同对于下胚轴形成的愈伤组织2,4-D0.5mg/L+KT1.0mg/L是一个较为理想的组合，茎的愈伤组织在1.0mg/L的2,4-D与1.5-2.0mg/L的KT 配合使用时，生长量与KT呈正相关，而在0.5mg/L的2,4-D条件下，3.0mg/L的KT 反不如1.0mg/L 的KT效果好2 苜蓿遗传工程由于苜蓿在畜牧生产上占有极其重要的地位与其它牧草相比，生物技术在苜蓿中的研究进行得较为深入各种研究手段，转化方法如原生质体融合、诱导变异、利用农杆菌介导、电击法、显微注射、基因枪直接导入外源DNA等均有成功报道另外，转化的内容也极为广泛，包括品质改良，抗除草剂，抗病虫害，抗逆性等2.1 突变体细胞筛选苜蓿经过脱分化或原生质体形成的再生植株，会产生变异，实验证明这些变异有些是可遗传的，而培养基中加入有毒物质或实验材料经过处理，产生变异机会更大这是利用体细胞无性系变异选育新品系的基本原理在抗寒突变体的筛选方面：由继红等 [6]报道，以紫花苜蓿叶片诱导产生的愈伤组织（诱导时间在一个月左右，继代次数不超过三代）为诱变供试材料，以EMS为诱变剂，进行低温筛选，成功地获得了抗寒性突变体。

另外，已有许多的研究表明，生物胁迫和非生物胁迫都与活性氧有关超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）能消除活性氧对细胞膜的伤害Mckersie等 [6]1993年将烟草的 Mn-SODcDNA 导入苜蓿后,转基因苜蓿的抗寒性得到了提高，并保持有较高的生活力在抗旱方面：张志胜和赵世绪 [7]1995年以PEG为诱导剂和筛选剂，通过三种途径获得了抗旱性稳定的，抗20％PEG 和抗25％PEG的愈伤组织以及抗20％PEG 的带芽愈伤组织，并从抗20％PEG 的愈伤组织和带芽愈伤组织获得了再生植株在抗盐性选择方面：Croughan 等 [8]选择的紫花苜蓿耐盐细胞系可忍耐1％NaCl，中国农科院北京畜牧所也筛选出了在含盐量为0.3％的土壤中生长良好的苜蓿再生植株2.2 体细胞杂交尽管苜蓿是优良的豆科牧草，但反刍动物采食新鲜茎叶后易得膨胀病，而红豆草、驴喜豆等植物中的凝缩单宁物质可以防止反刍家畜膨胀病的发生为此人们大胆设想，若能将红豆草、驴喜豆中不致膨胀病的基因转入苜蓿中去，苜蓿就可产生适量单宁，从而有效避免膨胀病的发生因此，体细胞杂交不失为一种有效的方法Teoule[9]最早在苜蓿的育种中利用了体细胞杂交技术，他把杂交可育的紫花苜蓿 M.sativ(2n=4x=32)和F.alcata(2n=4x=32)的原生质体融合，获得了第一株体细胞杂交植株。

在我国，徐子勤和贾敬芬 [10]报道，通过原生质体融合和培养，成功地获得了苜蓿红豆草属间体细胞杂种植株另外，由苜蓿和驴喜豆细胞融合也已得到杂种植株然而，种属间体细胞杂交所得到的杂种，一般DNA 倾向于苜蓿，我们所期望导入的优良基因等遗传物质通常是被排斥的，所以，通过体细胞融合来改良紫花苜蓿的工作尚需进一步研究2.3 外源DNA导入2.3.1 品质改良基因工程牧草品质包括很多内容，最主要的有营养品质和可消化性提高牧草饲料中蛋白质的含量，特别是含硫氨基酸（SAA ）如甲硫氨酸和半胱氨酸的含量，可显著增加羊的生长速度及羊毛产量早在1991年，Schroeder等 [11]首次将鸡卵清蛋白基因转人苜蓿，并在转基因植株中检测到了鸡卵清蛋白的增加澳大利亚针对紫花苜蓿叶中半胱氨酸含量低这一缺点，将能编码富集半胱氨酸的清蛋白的豌豆基因通过农杆菌导入苜蓿细胞，以这种转基因苜蓿喂羊，可提高羊毛产量5％在我国，吕德扬等 [12]（2000b）通过农杆菌介导法已将高含硫氨基酸蛋白基因（HNP）导入苜蓿，并成功地诱导出再生转基因植株对转基因植株进行氨基酸分析，发现含硫氨基酸的含量有明显提高同时吕德扬等 [13]（2000a）又报道了由发根农杆菌介导的高含硫氨基酸蛋白基因（HNP）和发根基因（rol）植株的再生。

改良牧草营养品质的另一方面是提高牧草或饲料的消化率人们发现牧草或饲料的消化率一定程度上决定于牧草中木质素的含量，通过降低木质素含量可大大提高牧草和饲料的可利用率和饲料的可消化性肉桂醇（酸）脱氢酶（CAD）是催化木质素单体合成的最后一步关键酶，牧草中木质素的生物合成受该酶调控1999年，Baucher 等 [14]用反转录RNA 技术成功地降低了苜蓿植株中CAD 酶的活性转基因植株中的木质素组成发生很大变化（虽然没有改变含量） ，从而提高了木质素的溶解性和消化率，减少了苜蓿茎干物质在细胞壁中的残留，大大增加了牧草的消化率和利用率2.3.2 抗病、虫基因工程病毒是以裸露的形式在植物细胞中繁殖和扩增的，研究人员发现，病毒的外壳蛋白（Coat Protein, CP ）可以通过重新包装病毒或抑制病毒脱壳来抵制病毒对植物细胞的破坏因此，向目标植物中导入病毒外壳蛋白基因，是目前植物抗病毒基因工程中最。