等温滴定量热法.docx

等温滴定量热技术摘要：生物大分子可以和很多配体特异性结合，当物质结合时，热量要么产生，要么吸收 生物大分子与配体相互作用的定量描述需要确定反应过程中热力学参数的变化相互作用过 程中产生的热量变化可以用量热计定量监测等温滴定量热技术（ Isothermal Titration Calorimetry, ITC）是一种监测由结合成分的添加而起始的任何化学反应的热力学技术，它已 经成为鉴定生物分子间相互作用的首选方法它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、 准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、和无损伤地同时提供热力学和动力 学信息，如结合常数（Ka）、结合位点数（n），结合^（A H）、熵（△$）、恒压热容（△ Cp）和动力学数据（如酶促反应的Km和kcat ）这些信息提供了生物分子相互作用的真 实写照由于几乎所有的生化反应过程都有热量变化，所以ITC具有很广泛的应用，它可 以应用于蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质折叠/去折叠、蛋白质-小分子相互作用、酶-抑制 剂相互作用、酶促反应动力学、药物DNA/RNA相互作用、RNA折叠、蛋白质-核酸相互作 用、核酸-小分子相互作用、核酸-核酸相互作用、生物分子-细胞相互作用等方面。

关键字：等温滴定量热技术、相互作用、热力学商业化的测量生物分子相互作用热量的灵敏的量热计出现在上世纪80年代后期［1］从 此这种技术被广泛应用在过去的20年中，等温滴定量热技术（ITC）成为研究相互作用 的常用方法随着现代ITC仪器的发展，ITC更加灵敏、快速、易用分子识别是一个复杂的过程，是生命活动的基础生物分子识别过程需要结合反应的热 力学参数来阐明等温滴定微量量热法可以直接定量检测滴定反应过程中的热量变化，确定 反应的结合常数Kb、结合计量比（n）、反应焓变（AH）、熵变QS）、恒压热容（ACp） 和动力学数据（如酶促反应的Km和kcat ）等热力学参数，用来表征生物分子间的相互作 用ITC已成为研究生物大分子结合反应的有力工具现代的ITC仪器可以测量0.1 u cal （0.4 nJ）的热效应，108 - 109M-1的结合常数，反应速率可以精确至10-12 mol/s，Km和kcat的测 量范围分别在10-2 - 103mM和0.05-500s［2］由于几乎所有的生化反应过程都有热量变化， ITC的应用非常广泛，包括涉及焓变的化学和生化结合反应以及一些复杂过程，比如酶动 力学。

与其他的研究方法相比，ITC不需要作任何的化学修饰或固定，可以直接地测量结 合焓许多生化反应可以在等温条件下完成，通过滴定改变样品的组成，为ITC提供了广 阔的潜在应用前景它对于阐明分子结合机制，结合分子结构进行药物设计等都有重要的作 用等温滴定量热技术简介ITC是一种热量连续变化的量热器主要由隔热夹套包裹着的样品池（反应池）和参比池、 注射器和一台计算机组成，注射器同时具有搅拌作用，计算机控制温度控制装置和信息反馈 系统（图1） ［3］恒温条件下当滴定进行前，首先反馈系统给样品池一个连续的能量确定基 线滴定进行时，注射器滴入反应物（通常是用小分子物质滴定大分子，本文中注射器中的 反应物称作配体，ligand，L）与样品池中被滴定物（本文中被滴定的反应物称作大分子， macromolecule，M）相互作用触发结合反应，形成大分子/配体复合物（macromolecule/ligand， ML）复合物的形成伴随着能量的释放或吸收，导致样品池温度的变化，参比池始终保持在 实验温度，反馈系统提供热或降低热量来补偿样品池的温度变化，每注射一次后系统恢复至 平衡状态再进行下一滴滴定结果以峰的形式表示平衡温度偏移所需要的能量，峰的面积相当于反应释放或吸收的热量。

随着池中反应趋于饱和，热量信号逐渐减弱知道只看到背景热 量(图 2)[2]图 1 ITC 结构示意图(2004, Current Protocols in Cell Biology)样品池和参比池由隔热夹套包裹，注射器将滴定物注射入样品池，同时作为搅拌器，计算机 控制温度控制装置和信息反馈系统图 2 ITC 的热量补偿系统(Matthew W. Freyer and Edwin A. Lewis， 2008)典型的ITC数据如图3,每次配体滴定入反应池中对应着一个峰，记录的信号是保持样 品池与参比池温度恒定需要添加或移除的热量，图3表示的是一个吸热反应每个注射峰上 面对应的面积积分与每次注射吸收的热量相当将得到的数据用软件（通常用origin软件） 与合适的模型进行拟合，就能得到相应的热力学参数：结合常数K、结合焓变AH、化学计 B量数n[2]在实验温度下，有了这些热力学数据就可以根据以下两个公式充分阐明反应中的 热力学变化：AG = -RT ln KB ；AG = AH -TAS；另一个重要的热力学参数恒压热容（^Cp）也可以通过测量一系列温度下AH的变化获 得：ACp = dAH/dT。

2-0432 一1 -0 - V 1 P T V 0 12 3 4（Liga nd]y [m acrom olecule}]-图 3 典型的 ITC 数据（2004, Current Protocols in Cell Biology）ITC操作流程ITC实验主要包括以下步骤：（i）确定合适的反应物浓度，（ii）准备样品，（iii）滴定，收集 数据，（iv）校正原始数据，（V）校正后的数据非线性回归得出热力学参数，（vi）分析模型 下面详细介绍每个步骤：（i）为了确保结合反应中热量的变化在ITC的测量范围之内首先要确定合适的反应物浓度 通常反应物的浓度在微克级，但是如果反应过程中热量变化很明显，可以适量降低反应物浓 度结合曲线的形状取决于结合常数KB和被滴定的大分子的摩尔浓度[Mt][1]:c=kb[mt]受C的影响的等温线的形状对结合常数起决定向作用，当C值高时（＞500），等温线的 形状几乎成直角，而且受kb的影响较小，当C值较低时，等温线趋平，不能输出有效的 KB （图4）[4]实验过程中为了精确测定KB最好使C值在10-100的范围之内因此，当结 合能力较强时（107-108M-1），需要低浓度的大分子反应物。

当结合能力不强时，可以适当增 加大分子反应物的浓度来获得较好的结合等温线10-11 -C™

此外，在疏水的反应物中可以加入适量的DMSO也会有利于ITC信号，但要保证注射器和 反应池中DMSO的浓度相同在配制反应物溶液时要避免产生气泡注射器中的气泡会影响注射体积并产生额外的热 信号，反应池中的气泡会干扰反应池壁感应溶液的热量变化所以在实验之前样品要进行抽 气处理根据实验需要准备适量体积的样品iii) 实验过程中测定的是配体滴入后样品池壁感受到的所有热量变化(Qmeas)，其中包括 了非特异性的热效应，如配体滴入后的稀释热、大分子的稀释热、搅拌热、样品池和注射器 的热量差、缓冲液组分微小的差异所以为了精确测量复合物形成时的热效应，除了设计的 滴定实验外，我们必须至少要做另外三个空白滴定实验一一配体滴缓冲液Qdil.ligand)、缓冲 液滴大分子溶液(Qdiyacromolecule)、缓冲液滴缓冲液(Qblank)开始滴定之前，要用抽过气的水和缓冲液清洗注射器和样品池，然后除去所有溶液， 干燥然后将大分子溶液注入样品池中，注射器中吸入配体溶液，整个过程中都要避免产生 气泡设定仪器程序一一注射次数、反应温度、参比功率、起始延迟、配体浓度、大分子浓 度、搅拌速度、注射体积、注射持续的时间、注射间隔时间、第一滴的注射体积(W3ul，一般不计入数据分析）。

一切准备就绪后，首先建立基线，当基线平稳没有大的噪音和漂移时开始滴定，三个 空白滴定的程序必须和样品滴定程序相同然后收集原始实验数据实验结束后清洗、干燥ITC.（iv）通常透析基本上已消除了搅拌和稀释热，但有时配体自身的稀释热不可忽略严格起 见，三个空白滴定实验的误差都要去除，得到校正后的热量（Qcorr）Qcorr =Qmeas - Qdil;ligand - Qdil;macromolecule - Qblank ⑵（V）分析ITC数据获得相关的热力学数据就要确定一个合适的结合反应模型就是用数学 方法描述量热计内的生化过程，用非线性回归确定最适模型但是所有的模型都不是生化过 程正确的模拟，但是它可以帮助我们理解实际的生化过程[2]非线性回归时一个非常复杂 的过程首先要估计模型方程中每一个参数，根据这些估计值，会根据实际数据曲线产生一 个理论曲线，误差函数会计算出实际和理论曲线间的面积偏差，然后用公认的算法改变各参 数使计算出的曲线更贴近实际曲线，这个过程会一遍遍重复，直到误差缩小到最小如果误 差不能在可接受的范围之内，就要试另一种模型目前非线性回归的这些过程都可以用计算 机软件（Origin）完成。

同时相关的热力学参数n、AH、AS. KB也会给出（图5）E.3300 60 00Time (min)2 oE«是.EwJEJwm-HE0.00图5原始的ITC数据和数据整合后的模型（2004, Remo Perozzo,Gerd Folkers,and LeonardoScapozza）（vi）正确理解反应过程首先要理解模型给出的各参数的正确意义根据模型给出的各种热 力学参数确定反应的相关性质结合位点数不同，平衡常数和物料平衡的表达公式是不同的（图6）单结合位点：K =（1-@）・[L]双结合位点：, 0| p"0 -O1）-[L] and A（i-Ml]多结合位点：K FL： A. _ '一[叩"一 ["L「PL 】/ [PLi乙=[L] - ：PL] + 2：PL?| -3[PU：(olly