免疫电镜技术.doc

免疫电镜技术免疫电镜技术免疫电镜(Immune electron microscopy)简介 （一） 原理 免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学它主要分为两大类：一类是免疫凝集电镜技术，即采用抗原抗体凝集反应后，再经负染色直接在电镜下观察；另一类则是免疫电镜定位技术该项技术是利用带有特殊标记的抗体与相应抗原相结合，在电子显微镜下观察，由于标准物形成一定的电子密度而指示出相应抗原所在的部位免疫电镜的应用，使得抗原和抗体定位的研究进入到亚细胞的水平二）影响免疫电镜的一些因素1．标记物 用于电镜观察的标记物有三类：一类是电子密度致密的标记物，如铁蛋白、辣根过氧化物酶等另一类则是放射性同位素，如 135I、35S、32P、14C、3H 等，第三类则是有独特形状的标记物，如血兰蛋白、噬菌体等对标记物的要求是：具有特定的形状、不影响抗原抗体复合物的特性与形状目前用于免疫电镜的标记物主要是铁蛋白和 HRP两者各有其优点，铁蛋白电子密度致密观察时反差大，优于酶标记，但铁蛋白分子量大(460 000)，穿透能力差，所以适于细胞表面抗原的定位，另外铁蛋白的标记过程比较复杂。

HRP 分子量小(40 000)，穿透力强，有利于标记抗体进入细胞内，适于细胞内的抗原定位2．固定剂 固定是免疫电镜较关键的一步，免疫电镜中的固定与一般超薄切片中的固定的不同之点在于既考虑保存细胞的超微结构,又要考虑到抗原的失活性问题1）固定剂的要求：①不损害细胞内抗原的活性；②固定速度快、效果好；③分子量小，易于渗透；④固定后,不引起交联，造成空间的阻碍，影响标记抗体进入抗原位2）影响固定的因素有：①采用固定剂的种类；②固定剂的浓度，浓度过大，对抗原的活性有影响，浓度过小，固定效果差；③固定剂的 pH；④固定剂的温度,一般采用 2℃～4℃冷固定；这样能降低细胞的自浴作用和水分的抽提；⑤固定时间与温度有关，温度高，固定快，也与缓冲系的离子强度有关，离子强度大，渗透压大，穿透力强，固定要快不同的固定剂，或同一固定剂的不同浓度所需的固定时间也不一致；⑥与被固定的细胞类型有关目前常用的固定系统有：4%聚甲醛，1.5%～2%戊二醛，1%多聚甲醛＋1%戊二醛，4%多聚甲醛＋0.5%苦味酸＋0.25%戊二醛，96%乙醇＋1%醋酸不论采用哪些系统，使用前必须用已知效价的抗原做一系列预实验如固定剂的种类浓度、温度、pH 及固定时间等。

然后做出预处理的效价，作为失活参考以再选择最适条件3．非特异性吸附 非特异性吸附与酶标抗体、抗血清的稀释度、染色时间，温度及介质等有关，其中最主要的是抗血清及标记抗体的稀释一般认为高效价抗血清或标记抗体稀释到低蛋白浓度，用于标记染色可获得最理想的结果因为低蛋白浓度有利于降低非特异性吸附实际应用的蛋白浓度大致在 0.50mg/ml～2mg/ml工作效价一般在 1︰20～1︰400,在实际工作中，将标记抗体或抗血清稀释到 1︰100 倍以上则可获得理想的阳性结果，而非特异性吸附必然降得很低工作浓度的选择是将标记抗体或抗血清作 1︰2、1︰4、1︰8……1︰256 的稀释，做已知阳性标本的标记染色观察，取其阳性沉积物明显，而非特异性吸附最低的一稀释度做为工作浓度4．标记染色法 标记染色法分为直接染色法与间接染色法两种前者的特点是特异性较高,敏感性低，标记抗体只能用于检测一种抗原后者敏感性较强，一种标记抗体可用于多种抗原的检测缺点是特异性较差铁蛋白免疫电镜技术（一） 原理 免疫铁蛋白技术是以铁蛋白标记抗体，再以铁蛋白抗体与待检抗原作用通过电镜检查，观察到铁蛋白抗体所在的位置，即抗原所在。

二）材料与试剂1．马脾铁蛋白2．硫酸铵3．硫酸镉4．双异氰酸镉二甲苯(Metaxylene dlisocyante XC)以 0.30Mol/L pH 9.5 硼酸盐缓冲液将 XC 配制成 1%溶液注意配制的水及容器必须特别清洁，配制后放置 4℃数天，以不出现沉淀为准如出现沉淀 XC 的多聚体形成，应重配5．0.30Mol/L pH 9.5 硼盐酸缓冲液6．0.1Mol/L 硫酸铵液7．0.05Mol/L pH 7.4 PBS 液（三）操作方法1．铁蛋白的提取⑴ 配制 2%硫酸铵液，并以 1Mol/L 的 NaOH 或 HCl 调 pH 值，正好为 5.85取 1g 铁蛋白溶于 100ml 的 2%硫酸铵液中⑵ 加入 20%硫酸镉，使最终浓度为 5%，混匀，4℃过夜⑶ 1 500g 离心(4℃)2h，去上清仍加 2%硫酸铵至 100ml，混匀，离心，去除不纯沉渣⑷ 于上清液中重新加入 20%硫酸镉，重复步骤⑵，离心，去上清⑸ 检查沉渣，置显微镜下检查，应具有典型的黄褐色结晶，结晶为六角形，双一四点结构，如结晶不典型，应继续重复以上步骤⑹ 以少量的蒸馏水溶解，再加 50%饱和硫酸铵溶液，使之沉淀，离心，去上清。

⑺ 重复步骤⑹一次⑻ 以少量蒸馏水溶解,常水透析 24h 后,以 0.05Mol/L pH 7.5PBS 透析 24h⑼ 100 000r/min 离心 2h，去除上部无色上清液(约 3/4 总量)，置 4℃过夜⑽ 用微孔滤膜(孔径 0.45μ)过滤，使铁蛋白含量为 65mg/ml～75mg/ml，分装，4℃保存不要冻干保存,以免铁蛋白结构遭破坏2．铁蛋白－抗体交联法⑴ 以 0.3Mol/L pH 9.5 硼酸盐缓冲液将铁蛋白稀释成 20mg/ml～25mg/ml⑵ 以 1︰1000(W/W)的比例加入 XC 液室温搅拌 45min，离心去沉淀⑶ 以 0.3Mol/L pH 9.5 硼酸盐缓冲液将提纯 lgG 配成 5mg/ml，以 1︰4 的比例(V/V)加入IgG 与铁蛋白－XC 液，4℃搅拌 48h⑷ 以 0.1Mol/L 碳酸铵溶液透析过夜，以除去多余的异氰酸盐，再以 0.05Mol/l pH 7.5 PBS 透析，使 pH 值恢复到生理水平⑸ 超速离心 以 1.00×105g 离心 5h，去上清，沉淀以 0.05Mol/L PBS 悬浮，再次离心，以除去未结合的 IgG⑹ 以血清学及免疫学方法测定结合抗体的特异性、免疫活性以及标记效应，如果操作步骤严格，结果是满意的。

3．铁蛋白－抗体结合物处理标本（1）将标本以 5%福尔马林 pH 7.2(4℃)PBS 液固定 40min～60min2）用冷的 PBS 液洗涤，离心3）如是组织块，则在解剖显微镜下切成更小块，放入试管中，加入铁蛋白－抗体结合物置室温 20min，不时振荡,（4）以冷 PBS 液洗涤三次，离心5）沉淀以 2.5%戊二醛固定 20min，以 PBS 洗涤6）再以锇酸固定，脱水包埋也可以先超薄切片，再进行铁蛋白－抗体结合物染色操作如下：⑴ 将培养细胞以 1%福尔马林 PBS 液固定(4℃)⑵ PBS 液洗涤离心⑶ 以 0.5ml,30%牛血清蛋白 PBS 液悬浮置入胶透析膜袋中，再将袋置于吸水剂粉末上，待牛血清白蛋白成胶状物时，将透析袋移至 2%戊二醛 PBS 液（pH7.5）中固定 3h⑷ 取出，切成小块，以 PBS 液洗涤⑸ 置干燥器中以硅胶干燥⑹ 包埋、切片、在水上收集切片置于经 4%牛血清白蛋白 PBS 液处理的披有胶膜的载网上(牛血清白蛋白的处理在于减少铁蛋白结合物非特异性吸附于载网上)⑺ 滴一滴铁蛋白－抗体结合物于载网上⑻ 5min 后，浮网于 PBS 液面,标本面向下，以除去多余的结合物。

⑼ 凉干后，滴一滴乙酸双氧铀或氢氧化铅以复染⑽ 水洗、晾干、电镜观察四）结果判定在已知对照样品成立的前提下，凡是出现黑色的铁分子颗粒即表示抗原的存在，判定阳性(＋)，否则判为阴性(－)酶免疫电镜操作步骤1．酶标抗体的制备2．取材 将培养细胞或悬浮细胞用 0.1Mol/L PBS 液冲洗，离心沉淀后，立即转入固定液(2%甲醛液或 2%戊二醛液均可)pH 7.2，4℃固定 5min～30min(依抗原性质所定)如病料为组织块，则取适当大小，先固定 1h 然后取出，以新的双面刀片切成 50～100 祄的薄组织再行固定 1h～2h3．漂洗 以 PBS 液漂洗过夜，换液 3～4 次4．血清孵育，25℃1h 或 4℃过夜，孵育的标本放置于加盖的瓷盘内，底层垫数层纱布防止抗血清干燥凝固，不易洗脱，造成非特异性吸附5．PBS 冲洗 3～4 次，每次 10min6．2.5%戊二醛再固定 15min～30min7．PBS 液冲洗 3～4 次每次 10min8．酶标记抗体孵育；用适当稀释的酶标抗体(即工作浓度)于 25℃湿盆内孵育 1h 或 4℃过夜9．PBS 液冲洗 3～4 次每次 10min 或 4℃漂洗过夜。

10．酶显色处理 将漂洗后的标本浸入 DAB－H2O2 底物溶液中，20℃，10min～30min显色强弱与戊二醛的固定有关若显色弱则可减少甚至取消戊二醛的固定时间冲洗时必须注意防止非特异漂浮的沉积11．常规包埋、切片、电镜观察 在经过脱水包埋确定抗原性不致引起失活的前提下可在包埋切片后做标记染色，切片一般在 2 祄～4 祄，切片后染色不存在通透困难的问题无论在标记染色后切片还是在切片后标记染色，最好在光镜下定位选择后，再做电镜定位包埋，这样目的性强，可减少工作量。