共转化ZxNHX-VP1-1基因百脉根的分子鉴定及抗逆性评价【毕业论文绝对精品】.docx

毕业论文（本科生）中文标题共转化ZxNHX・VPl・l皐因百脉根的分子鉴定及抗逆性评价英文标题 Molecular identification and tolerance evaluation ofZxVP]・l and ZxNHX gene in Lotus comiculafus学生姓名 指导教师 学 院草地农业科技学院专 业草业科学基地班年 级 兰州大学教务处目录摘要 错误！未定义书签Abstract 2UU S 31材料与方法 41.1转基因分子检测的材料 41.2转基因植株的分子检测 错误！未定义书签1.3转基因植株的RT-PCR检测 41.3.1植物总RNA的提取 41.3.2总RNA纯度及浓度检测 51.3.3总RNA完整性检测 51.3.4 RT-PCR 扩增 51.4转基因植株的抗逆性检测材料 51.5实验处理 51.5.1盐胁迫处理 错误！未定义书签1.5.2干旱胁迫处理 61.6测定指标 61.7数据分析 62结果 142.1植物基因组DNA的完整性检测 62.2转基因植株的PCR检测 62.3 口的基因在转基因百脉根中表达的RT-PCR分析 72.3.1植物总RNA浓度及纯度检验 错误！未定义书签。

2.3.2 RT-PCR 的分析 82.4 ZxNHX-ZxVP共转化百脉根株系具有更强的耐盐性 82.5 ZxNHX-ZxVP共转化百脉根株系具有更强的抗旱性 92.6转基因百脉根株系中积累了更多的阳离子 102.7 ZxVP和ZxNHX基因的超表达降低了转基因百脉根的叶片渗透势…••…122.8转基因百脉根株系的叶片具有较高的相对含水量 132.9转基因百脉根株系的细胞膜受损程度显著低于野生型植株 132.10转基因植株的净光合速率高于野生型植株 143讨论 144参考文献 175致谢 20评语 21共转^ZxNHX-VPhl基因百脉根的分子鉴定及抗逆性评价刘允佳指导老师：王锁民（兰州大学，草地农业科技学院，730000）摘要：本文以百脉根品种迈瑞博为实验材料，用根癌农杆菌介导的方法将携 带霸王离子区域化基因ZxNHX和ZxVPl-1的双价载体转入百脉根，用PCR及 RT-PCR检测得15株共转化百脉根植株，并对转基因植株的进行抗旱性耐盐性检 测，结果发现：（一）在干旱和盐胁迫下转基因百脉根生长更快，且耐盐抗旱性显 著增强二）阳离子含量的测定结果表明：不论在正常生长条件，述是在盐或干 旱胁迫下，转基I大I百脉根比野生型植株在叶和根中积累了更多的NaJ K+fllCa2+o （三）ZrNHX和ZxVPl-1基因的超衣达使得转基因1?脉根株系的细胞膜受损程度显 著低于野生型株系：随着NaCl浓度的增加或干旱胁迫时间的延长，转基因和野 生型株系的相对质膜透性均呈增加趋势，但野生植株增加的更快。

四）ZrNHX和 ZxVPl-1基因的超表达述可保护转基因百脉根的光合系统以上结果说明ZxNHX^WZxVPl-l的超表达促进了转基I大I百脉根细胞的Na*区 域化能力，同吋增强了其细胞对其它阳离子的吸收能力这一方面可以减少盐胁 迫下细胞质中过量Nf对各类细胞器和细胞膜的伤害作用，并稳定细胞内的离了 平衡；另一方面可将Na*作为一种有益的渗透调节剂来提高细胞的渗透调节能力, 使转基因百脉根能在盐或干旱胁迫下保持较多水分并维持细胞膨压，进而提高转 基因植株的耐盐抗旱性关键词：共转化百脉根ZxNHX ZxVPl-1耐盐性抗旱性Molecular identiflcation and tolerance evaluation ofZxVPl-1 and ZxNHX gene in Lotus corniculatusLiu Yun-JiaFaculty advisor: Wang Suo-MinCollege of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University,Lanzhou, Gansu Province 730000, ChinaAbstract : In this essay, Agrobactrium strain GV3101harboring the ZxNHX-ZxVPl -1 -pC AMBIA1302 plasmid was transformed into L. corniculatus to generate salt and drought-resistant legume forage and comprehensively assessed the tolerance of transgenic plants. The results indicated that: l.The over-expression of ZxNHX and ZxVPl-1 enhanced salt and drought tolerance in transgenic L. corniculatus. Under normal growth conditions, transgenic plants grew much faster and larger than wild-type plant. 2. The examinations of cations concentration showed that transgenic L. corniculatus accumulate more Na+, K+ and Ca2+ in leaves and roots than wild type under salt and drought treatments. 3. The over-expression of ZxNHX and ZxVPl-1 reduces the deleterious effect of excess Na+ in the cytosol.4. The over-expression of ZxNHX and ZxVPl-1 protects photosynthesis system of transgenic Lotus corniculatus.These results showed that the over-expression of ZxNHX and ZxVPl-1 increased sequestration of Na+ into vacuole and uptook capacity of other cations in the transgenic L. corniculatus. These mechanisms might reduce the deleterious effect of excess Na+ in the cytosol under salt stress and steady intracellular ion homeostasis and enhance the osmoregulation capacity of cells to increase the water retention and maintain the tolerance of transgenic L. corniculatus under salt or drought stress.Keywords： transgenic Lotus corniculatus, ZxNHX-ZxVPl-1, salt and droughttolerance刖吕近年来，受到全球气候和人口增长的影响，土壤干旱和盐碱化已成为人类而 临的世界性问题，也是制约作物生长及产量的两大非生物因素(Boyer, 1982)。

中 国干旱半干旱地区占全国国土面积的50.8%,主要分布于西北地区，是世界范围 内干旱情况最为严重的国家2—(山仑，2005)o中国西部地区的另一大环境问题 是由于干罕及频繁的人类活动所导致的土壤盐碱化因此，提高植物的耐盐抗旱 性是开发和利用大量盐渍化和荒漠化土地最有效，也是最根本的方法Z-o百脉^(Lotus comiculatus)是一种广泛分彳j于我国华东、华中、西南及西北 地区的优良豆科牧草，不仅营养丰富、皂素含量低、适口性好，而且在豆科牧草 中细胞再生性是最好的，遗传转化效率和对较高(程星等，2009)但大多数百脉 根栽培品种耐盐抗旱性差，在盐碱化和荒漠化土地上种植难以获得高产因此， 利用现代生物技术手段培育出耐盐、抗旱性显著提高的百脉根品系，对提高四北 地区百脉根人工草地产量以及改良和利用大面积盐碱地和荒漠化土地有重要意 义植物通过液泡膜Nf/H+逆向转运蛋白是抵御盐胁迫的有效策略Z-,在液 泡膜H+-ATPase和H+-PPase两个质子泵的驱动下，将细胞质中过多的Na*区域化至 液泡内，一方而减轻过量Na+对细胞质的伤害，另一方而将Nf作为一种廉价的渗 透调节剂，维持细胞的渗透势，从而提高植物的耐盐抗旱性(Blumwald和Poole, 1985; Apse等，1999)。

因此，液泡膜Nf/H*逆向转运蛋白及H+-PPase是两种垂耍 的耐盐抗旱决定因了，在植物耐盐抗旱性的遗传改良中具有重要价值(Moffat, 2002; Shi等，2003)o研究表明，超表达液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白或H=焦磷酸 酶(H+-PPase)编码基因均可增强植物的耐盐性和抗旱性(Apse等，1999)然而，以往研究的这些基I大I几乎都來自抗旱性不强的模式植物或农作物上, 冃多为单基因转化在-0.5 MPa的渗透胁迫下，50 mmol L-NaCl能显著提高霸王 的叶面积、净光合速率和气孔导度(马清等，2010)可见，霸王通过有效的将Nf 区域化至液泡来提高其耐盐性和抗旱性因此，实验室首次克隆了在植物Na*区 域化中起关键作用的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋口基因ZxNHX (EU103624) (Wu et al., 2010)和 H=PPase 基因 ZxVPl-1 (EU103625)并构建了 ZxVPl-1 的单价和 ZxNHX-ZxVPl-1的双价表达载体伍国强等，2010)进一步研究发现，ZxNHX隹 霸王Nf区域化中起着非常重耍的作用，且其在霸王中表达受到盐及干旱的调节。

而有关霸王液泡膜Nf/H+逆向转运蛋白和H+-PPase基因转化植物的研究尚未见 报道鉴于此，本研究以百脉根为实验材料，用根癌农杆菌介导法将含^ZxNHX- ZxVPl-1和ZxVP/J两个载体转入受体材料，以期得到耐盐抗旱性更强的转基因 植株，为培育百脉根新品系奠定基础1材料与方法1.1转基因分子检测的材料准备检测植物是已被农杆菌侵染形成的百脉根抗性苗百脉根的品种为迈瑞伯 (Mirabel),由甘肃农业大学曹致中教授提供其中农杆菌菌株为GV3101,为 本实验室保存，质粒为pCAMBIA1302,质粒携带霸土ZxVPl-1和ZrM/X基因(席 杰军，2010)o1.2转基因植株的分子检测参考CTAB改良法(黄萱等，2004)提取阳性转化植物和未转化植物的总 DNAo利用Primer 5.0软件，根据ZxVPl-1的核酸序列设计一对特异性引物Pl (5-GCTGGAATCGAATTTGTGGA-3,)和 P2 (5*-TGCAGCCTTATGTGCATCTG- 3J,其产物长度为471 bp；根据ZxAWX基因的核酸序列设计一对特界性引物P3 (5-CATCGGTGGTGCTTTTCAAT-3,)和 P4 (5・GCAGCTCTACCAGCCATCA C・。