实验离心技术及酶学实验.ppt

实验三 离心技术及 酶学实验 v概念 生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大 的离心力作用，使悬浮的微小颗粒(细胞器、 生物大分子的沉淀等)以一定的速度沉降，从 而与溶液得以分离的一种技术沉降速度取决 于颗粒的质量、大小和密度，离心技术主要用 于各种生物样品的分离和制备 第一节 基本原理 v离心力 当一个粒子(生物大分子或细胞器)在高速 旋转下受到离心力作用时，此离心力“F” 由下式定义，即： v相对离心力（RCF） 通常离心力常用地球的引力的倍数来表 示，所以称为相对离心力 在离心场中，作用于颗粒的离心力相当 于地球重力的倍数，单位是重力加速度g（ 980cm/s2） v ∴ RCF = 1.119×10-5×(rpm)2r v(rpm-revolutions per minute为每分钟转数， r/min) v低速离心时常以转速“rpm”来表示 v高速离心时则以“g”表示 第二节 离心机的主要构造和类型 工业用离心机 离心机 制备性离心机 实验用离心机 分析性离心机 v一、制备性离心机的三类 1． 普通离心机：最大转速6000rpm左右 2． 高速冷冻离心机：最大转速为20000～ 25000rpm（r/min） 3．超速离心机：转速可达50000～80000rpm， 超速离心机装有真空系统，这是它与高速离 心机的主要区别。

二、转头 v1．角式转头 v2．荡平式转头： 这种转头是由吊着的4或6个自由活动 的吊桶(离心套管)构成 v3．区带转头： 区带转头无离心管，主要由一个转子 桶和可旋开的顶盖组成 v4． 垂直转头： 其离心管是垂直放置的 v5． 连续流动转头： 转头与区带转头类似，由转子桶和有入口和出口 的转头盖及附属装置组成 三、离心管 v塑料离心管常用材料有聚乙烯(PE)，聚碳酸 酯(PC)，聚丙烯(PP)等，其中PP管性能较好 塑料离心管的优点是透明(或半透明)，硬 度小，可用穿刺法取出梯度缺点是易变形 ，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短 v不锈钢管强度大，不变形，能抗热，抗冻， 抗化学腐蚀但用时也应避免接触强腐蚀性 的化学药品，如强酸、强碱等 v离心管盖 离心前必须盖严，配平时需带管盖重量 防止样品外泄、挥发 支持离心管，防止离心管变形 v制备性超速离心的分离方法 Ø差速沉降离心法 逐渐增加离心速度，或者低速、高速交替进 行离心，使不同的离心速度及不同离心时间 下分批分离的方法 用途：分离沉降系数相差较大的颗粒 优点：操作简便 缺点：分理效果差，颗粒受挤压易变性失活 Ø密度梯度区带离心法（区带离心法） 定义：将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉 降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分 配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带 的分离方法。

优点：分理效果好、适应范围广、颗粒不会挤 压变形保持活性 缺点：离心时间长、需制备惰性梯度介质溶液 、操作严格不易掌握 五、离心操作的注意事项 v使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地 平衡离心管和其内容物，转头中绝对不能装载 单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必 须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地 分布在转头的周围 v每个转头各有其最高允许转速和使用累计期限 ，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用 v装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说 明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合 的离心管，有的离心管无盖，液体不得装得过多 ，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被 腐蚀;而制备性超速离心机的离心管，则常常要 求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上 部凹陷变形 v若要在低于室温的温度下离心时转头在使用 前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷 v离心过程中不得随意离开 实验内容 v酶的提取及比活性测定 一、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)的分离纯化及 比活性测定 [目的] 1．掌握AKP分离纯化的实验原理、方法 及注 意事项 2．了解检测AKP活性测定的原理和方法。

v方法 酶的本质：蛋白质 p盐析法 p有机溶剂沉淀法 p层析法 p电泳 酶 组织细胞：先破碎细胞， 再用一定的试剂提取 体液：直接提取 方法 物理方法 化学方法 v原则 p制备的原料 p初期采用、后期采用方法 p影响因素 p影响因素 ØpH：最适pH Ø温度：低温时酶比较稳定，有机溶剂需预冷 Ø氧化：－SH对某些酶的活性必需，加入还原剂 Ø重金属离子污染：与－SH发生作用而失活：EDTA Ø蛋白酶的污染，PMSF、DFP Ø介质的极性和离子强度：疏水 最稳定pH v评估指标 p酶的纯度－－用比活性代表 Ø定义：单位重量（mg）蛋白样品中所含酶的活性单位 Ø表示方法：每mg蛋白质所具有酶的活性单位 Ø测定方法：①每ml样品中的蛋白质mg数 ②每ml样品中酶的活性单位 酶的活性单位：酶促反应在单位时间（秒、分钟、小时） 内生成一定量的产物或消耗一定量的底物所需要的酶量 p酶的回收率 提取纯化过程中杂蛋白逐步去除，同时伴随 部分酶的损失 在保证纯度的前提下，应尽可能提高酶的收 率 (一)碱性磷酸酶的分离提纯 [原理] 机械破碎法制备肝匀浆 匀浆液 低浓度醋酸钠：低渗破膜 低浓度醋酸镁：保护和稳定AKP 有机溶剂沉淀法分离纯化AKP 加入不同有机溶剂，重复离心 正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质 33％丙酮(30％乙醇)：AKP溶解 50％丙酮(60％乙醇)：AKP不溶解 [操作步骤] 25g肝组织剪碎 +0.01M醋酸镁-醋酸钠溶液75ml，匀浆机中匀浆 取肝匀浆4ml(A液） A1：取0.1mlA液+1.9mlpH8.8Tris缓冲液，待测比活性 A2：取0.1mlA液+4.9ml生理盐水，待测蛋白浓度 +2ml正丁醇，混匀2min，室温置30min，离心 （ 2500rpm)5min 下清液（吸取） 沉淀（弃） +等体积丙酮，离心（2000rpm)5min 上清液（弃） 沉淀 +0.5M醋酸镁2ml溶解（B液） [操作步骤] B 液 +95%冷乙醇至30%，离心（2500rpm）5min 上清液（吸取） 沉淀（弃） + 95%冷乙醇至60%，离心（2500rpm）5min 上清液（弃） 沉淀 +0.01M 醋酸镁-醋酸钠2ml,溶解（C液） C1：取0.1mlC液+1.9mlpH8.8Tris缓冲液，待测比活性 C2：取0.1mlC液+0.1ml生理盐水，待测蛋白浓度 B1：取0.1mlB液+1.9mlpH8.8Tris缓冲液，待测比活性 B2：取0.1mlB液+0.9ml生理盐水，待测蛋白浓度 加入有机溶剂计算公式 设加入Xml95%乙醇 ※至终浓度30% 30%（B液体积+X）=95%×X X=30%B液体积÷95%-30%=0.462B液体积 ※至终浓度60% 60%（上清液体积+X）－30%上清液体积=95%X X=（60%-30%）上清液体积÷ 95%-60%=0.867上清液体积 [注意事项] l各步加入有机溶剂量要准确。

否则会影响整个实验结果 l操作要在低温下进行 l加入有机溶剂时要慢慢滴加，充分搅拌，避免局部浓度过高而引起升温 和变性 l加入有机溶剂混匀后不宜放置过久，应立即离心 l离心析出的蛋白质沉淀应立即将溶于适量的缓冲液中，以避免酶活力的 丧失 (二)碱性磷酸酶的比活性测定 [原理] Ø比活性的定义 l单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位 l通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示 l用以鉴定酶的纯化程度，是酶提取与纯化成功 与否的评价指标之一 Ø测定样品的比活性必须测定： l每毫升样品中的酶活性单位数 l每毫升样品中的蛋白质毫克数 Ø磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性 AKP 4-氨基安替比林 l磷酸苯二钠 酚 醌衍生物（红色） 铁氰化钾 根据红色的深浅用比色法测定酚的含量 l37℃保温15分钟产生1μg酚者为1个酶活性单位 Ø 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 回顾实验原理（实验讲义第60页） [操作步骤] 1.AKP活性单位测定 取试管5支，按下表操作： 试剂（ml）空白管标准管ABC 0.04mol/L基质液1.01.01.01.01.0 pH10碳酸缓冲液0.50.50.50.50.5 37℃水浴保温5分钟 蒸馏水0.1 ____ 酚标准液（0.1mg/ml） _ 0.1 ___ 测定液 __ A1液0.1B液0.1 C1液 0.1 混匀，立即置于37 ℃水浴保温15分钟 加0.2M NaOH溶液1ml 加0.3%4-氨基安替比林1ml, 0.5%铁氰化钾溶液2ml，混匀，室温 10min，各溶液进行A510测定 计算：酶活性单位/ml=A标本/A标准×C标准（0.1）×稀释倍 数 [操作步骤] 2. 蛋白质含量测定 取试管5支，按下表操作 试剂（ml）空白管标准管ABC 生理盐水0.1 标准蛋白溶液0.1 样品A2液0.1B2液0.1C2液0.1 考马斯亮蓝试剂5.05.05.05.05.0 室温5min，各管进行A595测定 计算：样品中蛋白质的含量（μl）=A样品/A标准×C标准×稀释倍数 3. 结果处理与分析 结果处理表 体积 (ml) 酶活性计算蛋白含量计算比活 性 (U/mg ) 酶的 得率 A 值 稀 释 倍 数 酶活性 (U/ml) 酶的总 活性（ U） A 值 稀 释 倍 数 蛋白浓度 (mg/ml) A 液 4100% B液2.2 C液2 （三）思考题 l 酶的提取纯化过程中应该注意哪些问题？如何评价酶的提 取与纯化成功与否？ l测定酶的比活性有何意义？ 。