几种土壤酶的测定方法.docx

土壤酶的测定方法 （一）蔗糖酶方法：比色法1试剂配制（1） 20%蔗糖（质量分数）（2） 甲苯（3） pH=5.5醋酸盐缓冲液：取120 ml冰醋酸用水稀释至1 L（a），取164 g无水CH3COONa 溶于水并稀释至1 L（b），将（a）与（b）二液按1:8混合再用pH计校正pH⑷ 0.2 M Na2HPO4 - 12H2O（5） 钼溶液：配制5%钼酸铵水溶液（a）,再取200 ml浓硫酸加800 ml水（b）使用前将 （a）、（b）二液按1:1混合6） 铜试剂：取50 g CuSO4・5H2O溶于500 ml水中（a）,取25 g Na2CO3> 25 g酒石酸钾钠、20 g NaHCO3和200 g Na2SO4溶于水并稀释至1 L再加几滴甲苯（b）使用前将（a）、（b）二 液混合7） 葡萄糖标准溶液：将葡萄糖先在50-58^条件下，真空干燥至恒重然后取500 mg溶 于100 ml苯甲酸溶液（饱和）中（5 mg还原糖/ml）,即成标准葡萄糖溶液再用标准液制 成1 ml含0.01-0.5 mg葡萄糖的工作溶液2标准曲线绘制：将（7）所述的葡萄糖标准溶液稀释成1 mg/ml还原糖工作液。

然后，取不同体积（0.5-50 ml） 工作液移于100 ml容量瓶中，加入10 ml pH=5.5醋酸盐缓冲液，用水稀释至刻度吸取此液5 ml移于100 ml容量瓶中，加4 ml铜试剂在沸腾水浴上放置25 min，冷却至室 温再加2 ml 0.2 M磷酸氢二钠和5 ml钼溶液，显色1 min定容，在分光光度计上于578 nm 处比色，根据光密度值和浓度绘制标准曲线3操作步骤取10 g 土壤（&填料）置于100 ml容量瓶中，加2 ml甲苯15 min后加10 ml 20 %蔗糖和10 ml pH=5.5醋酸盐缓冲液，置于37^恒温箱中培养24 h培养结束后，过滤并定容，按绘 制标准曲线操作步骤显色、比色试验设用水代替基质的对照（空白）4蔗糖酶活性，以24 h后10 g 土壤（&填料）中葡萄糖毫克数表示二）脲酶方法：比色法1试剂配制（1） pH=6.7柠檬酸盐缓冲液：取368 g柠檬酸溶于600 ml纯水中，另取295 g KOH溶于 水，再将二种溶液合并，用1 N NaOH溶液将pH调至6.7，并用水稀释至2 L2） 苯酚钠溶液：称取62.5 g苯酚溶于少量乙醇中，加2 ml甲醇和18.5 ml丙醇，然后 用乙醇稀释至100 ml（a），保存在冰箱中。

称27 g NaOH溶于100 ml水中（b），保 存在冰箱中使用前取（a）、（b）两液各20 ml混合，并用纯水稀释至100 ml备用3） 次氯酸钠溶液：用水稀释制剂，至活性氯的浓度为0.9 %，溶液稳定4） 10%尿素液（质量分数）（5） 甲苯（6） 氮的标准溶液：精确称取0.4717 g硫酸铵（（NH4）2SO4）溶于水并稀释至1 L，则得1 ml含0.1 mg氮的标准液绘制标准曲线时，可再将此液稀释10倍供用2标准曲线绘制：吸取稀释的标准液1、3、5、7、9、11、13 ml，移于50 ml容量瓶中，然后加纯水至20 ml再加4 ml苯酚钠溶液和3 ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀20 min后显色，定容1 h内在 分光光度计上于波长578 nm处比色根据光密度值与溶液浓度绘制标准曲线3操作步骤取5 g风干样品（土壤&填料），置于50 ml三角瓶中，加1 ml甲苯，15 min后加10 ml 10% 尿素液和20 ml pH=6.7柠檬酸盐缓冲液摇匀后在37°C恒温箱中培养24 h过滤后取3 ml 滤液注入50 ml容量瓶中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定4计算：脲酶活性以24 h后1 g样品（土壤&填料）中NH3-N的毫克数表示。

NH 3 - N （mg） = a x 2式中：a-从标准曲线查的的NH3-N毫克数2-换算成1 g样品的系数（三）磷酸酶方法：磷酸苯二钠比色法1原理：在碱性条件下，当存在氧化剂铁氰化钾时，酚被氧化成醍，醍又与4-氨基氨替比 林络合呈玫瑰色，颜色深度与酚量相关，通过比色测定游离酚量2试剂配制（1） pH=9.8氯化铵-氢氧化铵缓冲液：取20 g纯氯化铵，溶于100 ml浓氢氧化铵中2） 8%铁氰化钾溶液：取8 g铁氰化钾，溶于纯水中，稀释至100 ml （此液只能用一周）3） 2% 4-氨基氨替比林溶液：取2 g 4-氨基氨替比林溶于水中，稀释至100 ml （此液只 能用一周）4） 0.5%磷酸苯二钠溶液（质量分数）5） 酚的标准溶液：酚原液-取1 g重蒸酚溶于纯水中，稀释至1 L，贮于棕色瓶中 酚工作液-取10 ml酚原液稀释至1 L （每毫升含0.01 mg酚）6） 甲苯3标准曲线绘制：取1、3、5、7、9、11、13 ml酚工作液（0.01 g/L），置于50 ml容量瓶中， 分别加入20 ml纯水，再加入0.25 ml缓冲液，0.5 ml 4-氨基氨替比林溶液，0.5 ml铁氰化钾 溶液。

每次加入试剂要充分摇动，最后定容至50 ml在15 min内，在分光光度计上于510 nm处比色测定溶液的光密度，最后绘成标准曲线4操作步骤:称取5 g样品（土壤&填料），置于50 ml三角瓶中，加5滴甲苯后再加20 ml 0.5% 磷酸苯二钠，充分震荡后于37r恒温箱中，培养2 h取培养后的滤液5 ml，并按绘制标准曲线所述方法显色，比色测定5结果计算：磷酸酶活性，以2 h后100 g 土壤&填料中P2O5的毫克数表示PO （mg） = a X 80 x 0.32 x 2.292 5式中：a-5 ml滤液中酚的毫克数80-换算为100 g样品（土壤&填料）的系数0.32-以磷单位表示结果的系数（在磷酸苯二钠中，1个重量单位的酚，相当于0.32 重量单位的磷）2.29-将 P换算为P2O5的系数（四）蛋白酶方法：比色法1试剂配制（1） 1%酪素溶液：用pH=7.4的0.2 M磷酸盐缓冲液配制（质量分数）（2） 0.1 N 硫酸（3） 20%硫酸钠（质量分数）（4） 2%茚三酮液：2 g茚三酮溶于100 ml丙酮（5） 甲苯（6） 甘氨酸标准溶液：取0.1 g甘氨酸溶于水中，定容至1 L，则得1 ml含0.02 mg氨基氮 的标准溶液。

再稀释10倍制成工作液2标准曲线绘制：分别吸取工作液1、3、5、7、9、11 ml移于50 ml容量瓶中，加1 ml茚 三酮，冲洗瓶颈后在沸水浴上加热10 min，将获得的着色溶液用纯水稀释至刻度在分光光 度计上于500 nm处比色测定颜色深度以光密度为纵坐标，以氨基氮浓度为横坐标，绘制 曲线3操作步骤：称取4 g样品（土壤&填料），置于50 ml三角瓶中，加20 ml 1%酪素液和1 ml 甲苯，小心振荡后用木塞塞紧，在30^恒温箱中放置24 h培养结束后，于混合物中加2 ml 0.1 N硫酸和12 ml 20%硫酸钠液，以沉淀蛋白质，然后离心15 min （6000转/分）取上清 液2 ml，置于50 ml容量瓶中，按绘制标准曲线显色方法进行比色测定每个样品均要无基质对照，以除掉样品（土壤&填料）原来含有的氨基氮而引起的误差整 个试验要做无样品（土壤&填料）对照4结果计算：蛋白酶活性，以24 h后1 g样品（土壤&填料）中氨基氮的毫克数表示NH 2 - N （mg） = a x 5式中：a-从标准曲线查得氨基氮毫克数5-换算成1 g 土的系数。