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实验总结的几种高效酿酒酵母转化方法（总3页）--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可-- --内页可以根据需求调整合适字体及大小--电转法设计方案一：感受态制备：1. 挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30°C、250-300rpm培养过夜；2. 取1mL 一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30C、250-300rpm 培养约 16-18h（OD:；3. 于4C离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤一次后，细胞用10ml冰无菌水 重悬，可换成较小的离心管；4. 加入1ml,,10XTE缓冲液，摇晃均匀，再加入1ml 10XLiAc，旋转 摇匀，于30度轻轻摇动45min；5. 再加入1 mol/L DTT，并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min；6. 于4C离心，弃上清（用枪吸），再用25mL冰无菌水洗涤；7. 冰冷的1mol/L山梨醇洗涤，离心收集菌体，弃上清（用枪吸）；8. 每管用100ul山梨醇溶解，分装于EP管中（80ul/管），于-70C冰箱保 存电转化：1. 向感受态细胞中加入约5〜10ug（体积小于10 ul）的DNA，用枪吹吸均 匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min；2. 擦干电转杯，电击，电击参数：，25uF，200欧姆；3. 立即加入1ml预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30C静置1h；4. 离心，弃上清，加入1mL YEPD后，于30C、200rpm培养2h；5. 离心得菌体后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板进行涂板。

说明：该方法可直接采用50或100mL体系的一步法，即直接挑单菌落于 YEPD中培养至预定菌浓，也可采用试管摇菌收集菌体制备感受态设计方案二：感受态制备：1. 挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30C、250-300rpm培养过夜；2. 取1mL 一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30C、250-300rpm 培养约 16-18h（OD:；3. 于4C， 5000rpm， 5min离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤后，细胞重悬 于8ml处理液中（处理液配方：100 mM LiAc， 10 mM DTT， M山梨醇， 10 mM Tris-HCl，pH ），室温静置 30min；4. 4C， 5000rpm， 5min离心收集菌体，用1mol/L预冷的山梨醇洗涤三次，离 心条件一样；5. 每管用100ul山梨醇溶解（以黄枪头能吸取为宜，菌浓低时可适量少加入山 梨醇），最后以80 ul的终体积转移至EP管中（菌体太多可适当放弃部 分），置于-70C冰箱保存电转化：1. 向感受态细胞中加入约3ug （体积小于10ul）的DNA，用枪吹吸均匀，转移 至预冷的电转杯中，静置5min；2. 擦干电转杯，电击，电击参数：，25uF，200欧姆；3. 立即加入1ml预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30°C静置1h；4. 离心，弃上清，加A1mL YEPD后，于30C、200rpm培养2h；5. 离心得菌体后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板进行涂板。

说明：处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独 于-20度保存，可配成100倍的贮备液制备体系可按比例放大设计方案二特别适合于采用一步法制备感受态细胞具体如下：1. 挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中或转接于50mL YEPD中，在30C、 250-300rpm条件下培养至OD=6-10 （为防止菌体老化，可将50mL培养体系 提早收获细胞，取菌体时，以1mL/次，取菌两次或三次不等，使用菌浓达 到预定的OD:6-10）；2. 取1 mL菌液分装于EP管中，于4C，12000rpm离心30s，弃上清；3. 收集菌体，用预冰的无菌水洗涤两次，离心条件一样；4. 所得菌体用1mL处理液（配方同上）于室温下处理30min；5. 离心，弃上清，加入1ml 1M预冷山梨醇，离心，弃上清，重复两次；6. 最终用1M预冷山梨醇溶解菌体至终体积为80 ul，于-70C冰箱保存；7. 电转方法同上8. 每一步的离心均30s即可，在较短的时间内制备出的感受态转化效率特别 高备注：OD检测均为600nm，空白参比为：YEPD，高浓测定时应稀释测定所有 无菌水与山梨醇均在冰上预冷处理；在制备感受态阶段，所有离心均在4C条 件下。

醋酸锂转化法方案一：1. 挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30C、200rpm培养过夜；2. 取1mL 一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30C、250-300rpm 培养约5h（OD:；3. 于4C， 5000rpm， 5min离心收集菌体;4. 25mL冰无菌水洗涤两次，离心条件一样；5. 用1mL LiAc悬浮，离心收集菌体；6. 再用LiAc悬浮，以50 ul/管分装于EP管中，置于冰上备用；7. 依次向上述50 ul感受态细胞中加入 50% PEG3350 : 240ul、1M LiCl：36ul、2mg/ml 单链 DNA： 50ul、转化 DNA （5-10ug）： 50ul；8. 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；9. 30C水浴孵育30min；10. 42°C水浴热休克20〜25min；11. 13000rpm离心30s收集酵母菌体，重悬酵母于1ml YEPD培养基，30C 摇床孵育4h；12. 离心收集沉淀菌体，取除约800 ul上清液，然后按每100 ul/板进行涨 涂板―r—T 匕 万案一:1、 接种液体YEPD培养基，过夜培养至1 -2X107cells/ml；2、 取1mL 一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30C、250-300rpm 培养约5h(OD:；3、 收集细胞，并用无菌水清洗，之后用1ml无菌水重悬，并转移到离心管；4、 1ml TE/LiAC (10XTE[ M Tris-HCI, M EDTA,pH ]； lOXLiAc[1 M LiAcpH )清洗细胞，然后用1XTE/LiAC重悬至2X109 cells/ml；5、 离心管中取50u悬浮液，用1ug转化片段和50ug单链鲑鱼精DNA混合；6、 加入300ul灭菌的40%PEG溶液，剧烈混匀；7、 30度振荡培养30min；8、 42度水浴热击15min；9、 离心5s，用1ml 1XTE重悬，适当稀释后涂布于选择培养基。

附：电转法方案一中的处量液配制方法：1. A 液成份：100 mM LiAc，M 山梨醇，10 mM Tris-HCl，pH ；配制量： 500mL称取山梨醇，用适量dd无菌水溶解于500 mL容量瓶中；事先配制1 M LiAc母液，再从LiAc母液中取50mL至所述容量瓶中；事先配好1M Tris-HCl (pH )，再取5mL至所述容量瓶中；用dd无菌水定量至500mL，转移至试剂瓶中，于4C保存2. B液成份(母液)：1 M DTT 配制量：20mL2.1称取DTT，加入到50mL小烧杯内；2.2加入20 mL的NaOAc，溶解后使用滤器过滤除菌；2.3适量分成小份后，-20C保存3. 在使用时按每50mL菌体量用8mL处理液(A+B)以50mL菌体为例：取A 液8mL，再取80ul 1 M DTT于小三角瓶中混匀，备用。