实验8考马斯亮蓝染色显示细胞骨架.ppt

实验实验 8 8 考马斯亮蓝染色显示细胞骨架考马斯亮蓝染色显示细胞骨架1、了解细胞骨架成分显示方法的原理和操作步骤；、了解细胞骨架成分显示方法的原理和操作步骤；2、观察微丝在细胞中的分布观察微丝在细胞中的分布一、实验目的一、实验目的2024/9/161•细胞骨架的概念为真核细胞胞质中的蛋白质构成的纤细胞骨架的概念为真核细胞胞质中的蛋白质构成的纤维系统，在细胞的形态维持、细胞的运动、物质运输维系统，在细胞的形态维持、细胞的运动、物质运输和细胞分裂中发挥重要作用三种组成成分：和细胞分裂中发挥重要作用三种组成成分： 微丝、微丝、微管、微管、 中等纤维中等纤维•非肌细胞中的微丝是动态结构，肌动蛋白单体（非肌细胞中的微丝是动态结构，肌动蛋白单体（G-G-actinactin）与纤维（）与纤维（F-actinF-actin）在一定条件下互相转化在一定条件下互相转化本实验中本实验中M-M-缓冲液提供的离子条件可使缓冲液提供的离子条件可使F-actinF-actin稳定 二、实验原理二、实验原理2024/9/162中等纤维中等纤维微管微管微丝微丝2024/9/163二、实验原理二、实验原理•考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250(Coomassie blue R250)R250(Coomassie blue R250)是一种蛋白质染是一种蛋白质染料，不能特异地显示细胞骨架蛋白。

用含非离子型去垢剂料，不能特异地显示细胞骨架蛋白用含非离子型去垢剂TritonX-100TritonX-100的缓冲液处理细胞，可将细胞的膜结构和部分的缓冲液处理细胞，可将细胞的膜结构和部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白质却被保留，用考蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白质却被保留，用考马斯亮蓝马斯亮蓝R 250R 250染色后，在光学显微镜下可见一种网状结构，染色后，在光学显微镜下可见一种网状结构，其主要成分为直径其主要成分为直径40nm40nm左右的微丝束左右的微丝束• 观观察察时时可可能能会会发发现现细细胞胞膜膜上上有有些些孔孔洞洞，，甚甚至至有有些些细细胞胞变变空空了了，，这这可可能能是是由由于于Triton Triton X-100X-100处处理理时时间间过过久久破破坏坏细细胞胞结构所致结构所致2024/9/164培养的成纤维细胞用培养的成纤维细胞用Coomassie blue染色的结果染色的结果2024/9/165显示细胞骨架成分的特异性方法显示细胞骨架成分的特异性方法1 1、特异性的药物结合反应：、特异性的药物结合反应： 如罗丹明标记的鬼笔环肽，可以显示微丝如罗丹明标记的鬼笔环肽，可以显示微丝2 2、免疫细胞化学方法：、免疫细胞化学方法： 制备细胞骨架蛋白的特异性抗体，用免疫制备细胞骨架蛋白的特异性抗体，用免疫荧光、免疫酶标的方法显示细胞骨架荧光、免疫酶标的方法显示细胞骨架2024/9/166免疫荧光染色免疫荧光染色左：微丝，中：微管左：微丝，中：微管 ，右：中等纤维，右：中等纤维2024/9/167三、实验用品三、实验用品 复式显微镜（带油浸物镜）复式显微镜（带油浸物镜） 擦擦镜镜纸纸（（lens paper））；；记记号号笔笔；；小小片片滤滤纸纸；；载载玻片；盖玻片；剪刀；镊子；洋葱鳞茎玻片；盖玻片；剪刀；镊子；洋葱鳞茎 ① ①1% TritonX-100；； ② ②M缓冲液；缓冲液； ③ ③3%戊二醛；戊二醛； ④ ④pH6.8 磷酸缓冲液；磷酸缓冲液； ⑤ ⑤0.2%考马斯亮蓝考马斯亮蓝R-250染色液染色液2024/9/168四、实验步骤四、实验步骤1．用镊子撕取洋葱鳞茎内侧的表皮，剪成约．用镊子撕取洋葱鳞茎内侧的表皮，剪成约1cm见方。

见方置于置于pH6.8的磷酸缓冲液中，使其下沉的磷酸缓冲液中，使其下沉（（每人做每人做2片，片，不要太大，否则不易展开）不要太大，否则不易展开）2．吸弃磷酸缓冲液，用．吸弃磷酸缓冲液，用1% TritonX-100处理处理20 mins对照组使用对照组使用M缓冲液处理缓冲液处理3．．M缓冲液洗缓冲液洗5 mins X 3 times4．．3%戊二醛固定戊二醛固定30 min（或（或Carnoy固定液）固定液）5．磷酸缓冲液洗．磷酸缓冲液洗5 mins X 3 times 6．．0.2%考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝染色30 mins，蒸馏水冲液洗一次，，蒸馏水冲液洗一次，5分钟然后将表皮（带少量液体）平铺在载玻片上，加分钟然后将表皮（带少量液体）平铺在载玻片上，加盖玻片，显微镜下观察盖玻片，显微镜下观察2024/9/169•洋葱表皮细胞（200倍）五、实验结果五、实验结果2024/9/1610•洋葱表皮细胞（400倍）五、实验结果五、实验结果2024/9/1611•洋葱表皮细胞（对照组，100倍）五、实验结果五、实验结果2024/9/1612五、实验结果五、实验结果2024/9/1613六、六、实验报告告1.1.简单画出所观察到的图像（包括对照）的并分析。

简单画出所观察到的图像（包括对照）的并分析2.2.用用1%的的Triton X-100处理细胞的作用是什么？处理细胞的作用是什么？3.M缓冲液的作用是什么？缓冲液的作用是什么？2024/9/1614注意事注意事项•洋洋葱葱鳞鳞茎茎内内表表皮皮不不必必剪剪得得过过大大，，否否则则很很难难平平整整地地铺铺开开在在载载玻片上，而是部分重叠着，影响观察效果玻片上，而是部分重叠着，影响观察效果•另另外外，，在在用用高高倍倍镜镜观观察察之之前前要要盖盖上上盖盖玻玻片片，，如如果果载载玻玻片片上上较较干干，，最最好好先先滴滴上上一一滴滴水水后后再再盖盖盖盖玻玻片片，，以以免免造造成成很很多多气气泡，影响观察效果泡，影响观察效果•染色时间不宜过长，否则会染色过甚反而观察效果不佳染色时间不宜过长，否则会染色过甚反而观察效果不佳•用用1%Triton 1%Triton X-100X-100抽抽提提杂杂蛋蛋白白的的时时间间要要控控制制好好，，时时间间长长将将破坏细胞结构，抽提时间短背景干扰大，影响观察效果破坏细胞结构，抽提时间短背景干扰大，影响观察效果2024/9/1615。