里氏木霉原生质体的制备及转化.docx

里氏木霉原生质体的制备及转化摘要 本实验通过将含潮霉素 B 抗性标记的质粒 pAN7-1 转化至里氏木酶原生质体中，在含 100ug/ml潮霉素B的PDA平板上筛选转化子并予以验证，结果表明，在1kb处有潮霉素 抗性基因组，其中浓度为107个/ml的转化子效果最好关键词 里氏木酶 原生质制备 转化 前言 纤维素是自然界提供给人类的最宝贵的财富，植物每年通过光合作用产生数千亿吨 的纤维素， 但目前只有一小部分用于纺织、 造纸、 建筑和饲料等方面木霉属是迄今被 认为纤维素酶成分最全面， 分解天然纤维素活力最高的一类菌在育种方面利用高能电子、 紫外线、 亚硝基胍处理和原生质体融合等方法， 使酶的活力得到很大的提高本试验对里 氏木霉原生质体的制备及转化进行了研究,为进一步的育种工作奠定基础1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株及质粒来源里氏木霉 QM9414 和质粒 pAN7-1 由深 圳大学生命科学学院 S402 实验室刘刚老师 提供1.1.2试剂及培养基的配制1.1.2.1 Mandels 营养盐浓缩液配制 （NH4）2SO4 14 g,尿素 3 g，KH2PO4 20 g， CaCI2・2H2O 4 g，MgSO4-7H2O 3 g，dd^O 定容至1L1.1.2.2 Mandels 微量元素浓缩液配 制FeSO4-7H2O 5 g， ZnSO4-7H2O 1.7 g， COCI2-6H2O 23-7 g，MnSO4-H2O 1-6 g，ddH2O 定容至 1L1.1.2.3 1 M 柠檬酸缓冲液配制 柠檬酸 210 g，NaOH （纯度 96 %）78 g， ddH2O 750 ml，冷却后定容至1L1.1.2.4 60％的 PEG400050 mM CaCl2，10 mM Tris・Cl （pH 7.5），60 g PEG4000加水定容到100 ml1M CaCl2 5ml，1M Tris •Cl（pH 7.5）1ml， PEG4000 60g， ddH2O 定容至100 ml1.1.2.5 STC山梨醇218.6g （所需浓度为1.2 M），1M Tris・Cl（pH 7.5）10ml （所需浓度为 10 mM），1M CaCl2 50m（l 所需浓度为50 mM）， ddH2O定容至 1L1.1.2.6 PDA 培养基去皮土豆200g，葡萄糖20g，琼脂（Agar） 15g， ddH2O 定容至 1L其中 20 %土豆浸出液制作方法如下：将土豆去皮切碎，每20 g 土豆加水100 ml， 置电炉上煮 20 分钟，用纱布过滤，定容。

筛选里氏木霉转化子时加入终浓度为 100 yg/ml潮霉素1.1.2.7 里氏木霉种子培养基培养里氏木霉转化子时加入终浓度为100 yg/ml 潮霉素 Mandels 营养液浓缩液100 ml， Mandels 微量元素浓缩液 1 ml， 1 M 的柠檬酸缓冲液（pH 4.5）50 ml，吐温80 2 ml,蛋白胨 1g，ddH2O 定容至 900 ml，D- 葡萄糖（单灭后加入）20g溶于100 ml ddH2O1.1.2.8 原生质体再生培养基用于里氏木霉原生质体再生培养，为含 有 STC 的里氏木霉种子培养基1.2M STC 500 ml，Mandels 营养液浓 缩液 100 ml， Mandels 微量元素浓缩液 1 ml，1 M的柠檬酸缓冲液（pH 4.5）50 ml， 吐温80 2 ml，蛋白胨1g，ddH2O定容至 900 ml，D-葡萄糖（单灭后加入）20g溶于 100 ml ddH2O1.1.2.9 酶解液称取100mg溶壁酶（Sigma）溶于已灭 菌 10ml 1M MgSO4 后，用注射器过滤除菌， 以上步骤于无菌操作台中进行1.1.3 实验仪器高压灭菌锅、恒温培养箱、恒温摇床、 普通光学显微镜、高速台式冷冻离心机、无 菌操作台、血球计数板、电子天平、磁力搅 拌器、电泳槽、电泳仪、胶成像设备。

1.1.4 实验用具25ml 离心管、量筒、烧杯、三角瓶、 螺口玻璃瓶、培养皿、移液枪、枪头、注射 器、滤膜、纱布、酒精灯、接种环、玻璃棒 盖玻片1.2 方法1.2.1 里氏木霉原生质体的制备将里氏木霉QM9414菌种接到PDA平板 上，在28 °C恒温培养箱中培养7~10天， 待抱子长满整个平板后，用3 ml无菌水洗脱 孢子，利用血球计数板计对洗脱液中的孢子 进行计数，吸取含0.8-1.0X108个抱子的洗 脱液，加到抱子的50 ml里氏木霉种子培养 基中，28 C， 220 r/min振荡培养8.5 h等大部分孢子萌发后，镜检孢子的萌发 情况，将菌液转到 2 个 25 ml 的离心管中， 4 C，8000 r/min离心5min去除上清，菌 丝用 40ml 1 M MgSO4 各洗2遍8000 r/min 离心5min加10 ml酶解液于上述菌丝中， 重悬菌丝并置于 250ml 三角瓶中， 28 C， 70 r/min，温育2h,镜检原生质体的情况 往酶解中加入 40ml 的 STC， 4 C， 8000r/min离心15 min，沉淀原生质体去上清， 用 STC 溶液洗涤二次， 4 C， 8000 r/min， 离心15 min。

将原生质体悬浮于1ml STC溶 液1.2.2 原生质体的转化调整原生质体的浓度为108个/ml、107 个/ml和106个/ml，分别加入10憾、8憾 和6yg pAn7-1,轻轻混匀；48C热激2 min； 加入50 ill 60的6 PEG4000，于室温静置20 min溶液先转移到50ml离心管中，再加入 2 ml 60 %的PEG4000，混匀后于室温静置5 min；加入40 ml STC，4 C，11000 r/min 离 心25 min用1mlSTC溶液重悬原生质体沉 淀后加入到10 ml原生质体再生培养基中， 于28 C，70 r/min的条件下培养20 h培养后， 4 C， 8000 r/min 离心 10 min 去上清，用 1 ml STC 溶液悬浮沉淀，将悬浮 液涂布到5个含100 yg/ml潮霉素B的PDA 筛选平板上，28 C恒温培养2天1.2.3 转化子的筛选当观察到筛选平板上有黄色菌丝的长 出后，挑取单克隆（将菌丝连同其下方的一 层薄薄的琼脂块一同挖下），菌丝朝下转接 到含 100 yg/ml 潮霉素的 PDA 固体小平板 上, 28 C恒温培养7天1.2.4 转化子的的验证通过 Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR 来验证转化子。

取 50yl Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR 于灭菌的 Microtube 中，用灭菌牙签或枪头挑取单菌 落，置于Microtube中搅动几下后取出,80C 热变性15min，低速离心，取2yl裂解后的 上清液作为 PCR 反应的模板 PCR 反应体系如下表9所示，反应程序如图1所示表9验证转化子的PCR体系试剂体积LATaq0.25yl10X LA Buffer2yldNTP3.2yl引物 hph10.5yl引物 hph20.5yl模板2ylddH’O11.55yl94 °C 94 °C 55 °C 72 °C 72 °C 20°C5min 30s 30s lmin 7min ooI 30cycle 1图1验证转化子的PCR反应程序2 结果2.1 原生质体转化及转化子的初步鉴定图2 IO6个/ml原生质体转化平板图3 106个/ml转化后单克隆筛选平板图4 107个/ml原生质体转化平板图6 108个/ml原生质体转化平板图5 107个/ml转化后单克隆筛选平板图7 108个/ml转化后单克隆筛选平板2.3转化子的PCR验证7654321XXIo o o o ooo OP 0 0 5 0 0 50 5b 5 O 2 5 O 7* 5 24 3 2111、2： 108个/ml原生质体的转化子；3、4： 107个/ml原生质体的转化子;5、6： 106个/ml原生质体的转化子;图8原生质体转化子的PCR验证电泳图3. 讨论3.1 纤维素的酶促水解具有很高的应用价 值。

纤维素酶解在经济上的可行性主要受到 纤维素成本的限制为了降低纤维素的成本 可采用： 1.通过筛选的方法，选育出纤维素 酶高产菌株 2.优化纤维素酶高产菌种的培 养条件，进一步提高纤维素酶的发酵活力3.2 微生物能否较好地形成原生质体与 微生物的生理状态有一定的关系， 酶的作 用受菌龄的影响，菌龄过长，菌丝细胞壁易 发生老化增厚，不易于释放原生质体；过短 则菌丝体易破裂， 释放原生质数量较少 幼嫩的菌丝体有利于酶的作用，但并不是菌 丝体的菌龄越小， 原生质体的得率越高， 原因可能是随着菌的生长， 菌丝体细胞壁 的结构组成有所不同所致4. 结论成功制备里氏木酶原生质体成功转化 含潮霉素B抗性标记的质粒pAN7T转化至 里氏木酶原生质体中并验证浓度度为107 个/ml的转化子效果最好参考文献：[1] 李景富，王傲雪，等.里氏木酶产纤维素酶条件的优化.东北农业大学学报，2008，39（7） 29-33.[2] 张继泉，王瑞明，孙玉英，等.里氏木酶生产纤维素酶的研究进展.饲料工业，2003，24 （1）： 11-13.[3] 傅力，朱正兰，等•里氏木酶DWC原生质体制备条件的研究•新疆农业大学学报，2003, 26（2）： 52-55.。