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CRISPR-Cas9体系实验流程 (2) 二代测序RRBS一、材料试剂准备1）质粒：pSpCas9(BB)-2A-GFP (Addgene plasmid ID: 48138)，用于转染cas9，该质粒含有Cas9与GFP，Cas9的nickase活性将用于特定目的基因的ko，GFP可做为转染标签pSpCas9(BB) (Addgene plasmid ID: 42230)，若实验用sgRNA为PCR扩增纯化产物，则需要该质粒做为U6的模版pUC19(Invitrogen, cat.no.15364-011)可用于构建sgRNA，若用PCR产物进行转染，则需要该质粒来进行共转染，做为DNA carrier上述三种质粒，根据实验选择sgRNA的表达方式（PCR产物/ 单载体系统/ 双载体系统）来确定具体使用哪种2）超纯水，DNase/RNase-free (Life Technologies, cat. no. 10977-023)3）高保真聚合酶，Kapa HiFi (Kapa Biosystems), PfuUltra (Agilen)，Herculase II fusion polymerase 均可，只需保真效果好，扩增过程不产生突变。

4）Taq DNA polymerase with standard Taq buffer (NEB, cat. no. M0273S)用于一般检测5）QIAquick gel extraction kit (Qiagen, cat. no. 28704)6）QIAprep spin miniprep kit (Qiagen, cat. no. 27106)7）Fast Digest BbsI (BpiI) (Fermentas/Thermo Scientific, cat. no. FD1014)，如需要将sgRNA构建到pSpCas9(BB)-2A-GFP质粒上，则需要该酶8）T7 DNA ligase with 2 rapid ligation buffer (Enzymatics, cat. no. L602L). 或者T4 DNA ligase，二者无区别9）Stbl3 chemically competent E. coli (Life Technologies, cat. no. C7373-03)10）dNTP solution mix, 25 mM each (Enzymatics, cat. no. N205L)11）MgCl2, 25 mM (Thermo Scientific, cat. no. R0971)12）T4 polynucleotide kinase (New England BioLabs, cat. no. M0201S)13）Plasmid Safe ATP-dependent DNase (Epicentre, cat. no. E3101K)14）Adenosine 5′-triphosphate, 10 mM (New England BioLabs, cat. no. P0756S) 15）SOC medium (New England BioLabs, cat. no. B9020S)二、实验流程1）确定target site。

根据CRISPR设计工具http://crispr.mit.edu/设计sgRNA，（还有其他设计工具，推荐该软件）将目的基因250bp以内的核苷酸序列输入，避免内含子，约10min将会给出备选的target site或者人工手动选择，在目的区域5′-NGG（即PAM）上游20bp片段均可做为target site，一般target site可选在正义链或者反义链，二者均可2) 准备sgRNA表达体系三种方案可选：a, 直接使用PCR扩增纯化产物，该产物片段含有U6+sgRNA，约370bp；b, 将sgRNA载体构建到pSpCas9(BB)-2A-GFPpUC19质粒当中，即单载体系统；c, sgRNA载体构建到构二代测序RRBS建到pUC19当中，成为双载体系统a．PCR扩增sgRNA表达结构PCR体系如下：U6-Fwd: GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCU6-Rev:AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAA CGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAA c NNNNNNNNN NNNNNNNNNNCCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG(N即与target site反向互补配对的片段)其中聚合酶也可以使用pfu或者Kapa Hifi代替，高保真聚合酶即可，U6模版推荐使用pSpCas9(BB)。

PCR反应条件如下：该程序固定，不推荐更改PCR结束后，2%琼脂糖凝胶电泳验证，5ul PCR产物，15 V cm–1，30分条带位置为370bpPCR产物用QIAquick PCR purification kit纯化，依照试剂盒说明，最终取35ul EB buffer，或者水进行回收二代测序RRBSb. 构建sgRNA载体—单载体系统（pSpCas9(BB)-2A-GFP）首先，按照前述方法target site确定，根据target site设计需插入的sgRNA Oligo一般来说，sgRNA oligo的形式如下：sgRNA top: CACCgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNsgRNA bottom: AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNc两条设计好的oligo需经磷酸化，退火成双链，其体系如下：程序如下：37 C 30 min; 95 C 5 min; 每分钟降5 C 至25 C结束后按照1：200加水稀释（1ul oligo+199 H2O）其次，将合成好的sgRNA oligo插入到目的载体中，本实验将使用pSpCas9(BB)-2A-GFP其连接反应体系如下：二代测序RRBS其中pSpCas9(BB)-2A-GFP 100ng, 根据浓度调整体积。

连接1hr设计对照，对照同上，只是不加oligo连接反应条件如下：连接反应结束后，推荐使用PlasmidSafe exonuclease去除线性DNA残基，该步骤可选，但强烈建议该步操作37 C 30 min, 70 C 30 min之后保存到-20C，可保存至少一周该步骤结束后的产物可直接用于转化大肠杆菌，推荐使用Stbl3感受态采取热击的方法：取2ul PlasmidSafe后的质粒，加入到20ul感受态中，冰上10min，热击42 C，30 s，立即置于冰上2min，加入100ul SOC，直接涂板使用含有Amp100的LB平板37C过夜第二天观察，对照板应无克隆，而含sgRNA插入的板中长有克隆挑取单克隆摇菌，用QIAprep spin miniprep kit进行质粒提取用U6-Fwd primer做为测序引物测序二代测序RRBSc．sgRNA双载体表达系统（构建到pUC19中）若利用pUC19建立双载体表达系统，首先依旧是参照之前的方法，寻找target site，设计引物用于扩增U6+sgRNA scafford；Fwd引物需含E coRI，Rev引物需含HindIII 酶切位点。

之后进行酶切连接等操作酶切体系如下：U6+sgRNA PCR产物酶切pUC19质粒酶切酶切产物纯化，使用QIAQuick PCR purification kit，纯化后可-20 C保存连接：酶切后的质粒与PCR产物按照1：3，室温连接15min连接反应结束后，推荐用PlasmidSafe exonuclease去除线性DNA残基可选做）后续转化大肠杆菌，热击转化，涂板，挑单菌落，摇菌，提质粒，测序检测二代测序RRBS方法均与前述方法一致验证质粒构建正确后则可进行后续转染细胞实验通用pUC19测序引物：（只选一端用于测序即可）pUC-Fwd - M13：GTAAAACGACGGCCAGTpUC-Rev - M13：CAGGAAACAGCTGTAAC3）转染KYSE150等细胞首先培养细胞至汇合度70-90%转染可利用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，依照说明书进行转染转染方案如下：稳转：可先转染cas9，得到其稳转株其筛选流程如下，待按照lipo2000说明书转染后，2-3d，收细胞，计数，将细胞稀释60cells稀释在12ml培养基中，然后将这12ml培养基接种到96孔板中。

待长成克隆，观察绿色荧光即可或者直接进行流式单细胞分选，分选后的细胞分种到96孔板，待长成克隆单载体系统稳转可参照上述方法瞬转：依旧是参照说明书，转染后48-72小时收细胞，转染效率可参照GFP荧光信号，同时可进行WB或者qRT检测需注意的是sgRNA PCR产物的转染，其体系如下：注：本实验中Cas9将选用pSpCas9(BB)-2A-GFP，含有GFP标签二代测序RRBS附录:1.L ipofectamine 2000 (Invitrogen)转染体系如下表所示：2.二代测序RRBS3.pUC19 质粒图谱二代测序RRBS4.pSpCas9(BB)-2A-GFP质粒图谱二代测序RRBS5.pSpCas9(BB)质粒图谱-全文完-。