实验六酵母核糖核酸的分离及组分鉴定.ppt

单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,,,*,,,,,单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,,,*,,酵母核糖核酸的分离及组分鉴定,生物化学实验,1,,5’,5’,3’,3’,2,,一、实验目的,,1.,掌握,RNA,的提取方法,,2.,学会使用地衣酚法测定,RNA,的含量,,3.,熟悉和掌握离心机的使用方法,3,,二、实验原理,,由于,RNA,的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法其中苯酚法又是实验室最常用的组织匀浆用苯酚处理并离心后，,RNA,即溶于上层被苯酚饱和的水相中，,DNA,和蛋白质则留在苯酚层中，向水层加入乙醇后，,RNA,即以白色絮状沉淀析出此法能较好地除去,DNA,和蛋白质，提取的,RNA,具有生物活性酵母细胞富含核酸，且核酸主要是,RNA,，含量为干菌体的,2.67%-10.0%,，而,DNA,含量较少，仅为,0.03%-0.516%,为此提取,RNA,多以酵母为原料工业上制备,RNA,多选用低成本、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。

这两种方法所提取的核酸均为变性的,RNA,，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺比较简单4,,稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀,RNA,或调,pH2.5,利用等电点沉淀提取的,RNA,有不同程度的降解浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来RNA,含有核糖、嘌呤碱,/,嘧啶碱和磷酸各组分加硫酸煮可使,RNA,水解，从水解液中可用定糖，加钼酸铵沉淀（或用定磷法）和加银沉淀等方法测出上述组份的存在1,）嘌呤碱与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化合物沉淀2,）地衣酚显色法：核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变为糠醛，后者与地衣酚（,3,，,5-,二羟基甲苯）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂3,）磷酸与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀,[(NH4)3PO4,·,12MoO3↓],二、实验原理,,5,,,三、仪器、原料和试剂,,仪器：试管；,,烧杯：,100mL,；,,移液管：,0.2mL(×1),、,2.0mL(×2),、,1mL(×2),；,,量筒：,10 mL,、,50mL,各一个；,,滴管；,,电磁炉；,,离心机；,,布氏漏斗。

原料：干酵母粉,6,,低速离心机,7,,,三、仪器、原料和试剂,,试剂：,,（,1,）,0.2%,氢氧化钠溶液；,,（,2,）,10%,硫酸；,,（,3,）,0.1mol/L,硝酸银溶液（,5%,硝酸银溶液）；,,（,4,）,1mol/L,浓氨水；,,（,5,）酸性乙醇溶液：,30mL,乙醇加,0.3mL HCl,；,,（,6,）地衣酚试剂：,100mg,地衣酚，溶于,100ml,浓盐酸中，再加,100mgFeCl,3,·,6H,2,O,或等量的,CuO,；,,（,7,）定,P,试剂：,,,a.17%,硫酸：,17ml,浓硫酸（比重,1.84,）缓缓加入,83ml,水中,,,b.2.5%,钼酸铵溶液：,2.5g,钼酸铵溶于,100ml,水中,,,c.10%Vc,（抗坏血酸）溶液：,10g,抗坏血酸溶于,100ml,水中棕色瓶储存溶液程淡黄色尚可使用呈深黄色甚至棕色即失效临用时将上述三种溶液与水按如下比例混合，,a,：,b,：,c,：水,=1,：,1,：,1,：,2,,,8,,四、实验步骤,,1,、酵母,RNA,的提取,,（,1,）称,8g,干酵母粉悬浮于,40mL 0.2%NaOH,溶液的,100mL,烧杯中 沸水浴加热,30,分钟，不断搅拌。

2,）冷却后，,4000r/min,离心,8,分钟，将上清液慢慢倾入,20mL,酸性乙醇的烧杯中，边倒边搅而后静置,10,分钟，待,RNA,完全沉淀，,4000r/min,离心,8min,3,）弃去上清，沉淀为,RNA,粗制品2,、水解,,,RNA,粗制品转移至三角瓶中，加,10mL10%,硫酸，盖上漏斗，沸水浴,10,分钟，过滤，弃去滤渣，滤液备用9,,3,、,RNA,组分鉴定,,（,1,）嘌呤碱：取一支试管，加入,20,滴,5%,硝酸银溶液，逐滴加入浓氨水至沉淀消失，然后加入,20,滴水解液，静止，观察白色絮状沉淀生成即为嘌呤碱银化合物沉淀2,）核糖：取一支试管，加入,20,滴水解液，然后加入,20,滴地衣酚试剂，在沸水浴中加热,5,分钟，观察有没有变绿3,）磷酸：取一支试管，加入,20,滴水解液，然后加入,20,滴定,P,试剂，在沸水浴中加热,5,分钟，观察有没有变蓝10,,五、结果与讨论,11,,六、注意事项,稀碱法提取的,RNA,为变性,RNA,，可用于,RNA,组分鉴定及单核苷酸制备，不能作为,RNA,生物活性实验材料地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应因此地衣酚实验不能作为,RNA,与,DNA,鉴别的依据。

离心时要配平水浴时要搅拌，注意安全12,,七、思考题,,1. DNA,对本法测定,RNA,含量是否有影响,?,若有影响，如何消除,?,,2.,你能知道,CuO,或,FeCl3,·,6H2O,在地衣酚法测定,RNA,中的作用吗,?,13,,。