免疫印迹介绍及实验过程.docx

免疫印迹免疫印迹免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Westernblotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析结合化学发光检测，可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异免疫印迹法的基本原理将混合抗原样品在凝胶板上进行单向或双向电泳分离，然后取固定化基质膜与凝胶相贴在印迹纸的自然吸附力、电场力或其它外力作用下，使凝胶中的单一抗原组份转移到印迹纸上，并且固相化最后应用免疫覆盖液技术如免疫同位素探针或免疫酶探针等，对抗原固定化基质膜进行检测和分析免疫印迹法的基本步骤免疫印迹法（以抗原分析为例）基本上可分为抗原分离、抗原印迹和抗原检定三个步骤在每一步中因采用的具体实验方法不同，可构成多种免疫印迹分析系统免疫印迹法的优点免疫印迹法是一项分析抗原、抗体的技术它具有下列优点：1、湿的固定化基质膜柔韧，易于操作；2、固定化的生物大分子可均一的与各种免疫探针接近，不会象凝胶那样受孔径阻隔；3、免疫印迹分析只需少量试剂；4、孵育、洗涤的时间明显减短；5、可同时制作多个拷贝，用于多种分析和鉴定；6、结果以图谱形式可长期保存；7、免疫探针可通过降低PH值等方法，象抹去录音磁带一样将探针抹掉，再换用第二探针进行分析检测。

免疫印迹法的应用范围及优点不仅局限于此，它必将随着这一方法的深入研究而不断发展和完善免疫印迹免疫印迹又常称Westernblot，是一综合性的免疫学检测技术它利用SDS-PAGE技术将生物样品中的蛋白质分子按分子量的大小在凝胶上分离开，然后用电转移的方法将蛋白转移到固相膜上（NC、尼龙或PVDF膜），最后进行免疫学检测由于免疫学检测敏感性高，并且通过SDS-PAGE样品中的待检蛋白得到了浓缩，因此，Westernblot的灵敏度特别高，可达到放射免疫的分析水平而使用一般的免疫学检测技术（如ELISA、放射免疫沉淀）检测时，由于要求被检测蛋白可溶、要求抗体效价高、亲和力高和特异性强，往往并不容易达到目的而Westernblot却没有这些缺点因此，Westernblot广泛应用于生物样品中是否存在某一蛋白质（抗原）的检测也可用于粗略测定抗原蛋白的相对含量和抗原多肽链的相对分子量一、原理是SDS-PAGE电泳与免疫检测相结合的一种蛋白质检测方法强阴离子去污剂SDS与还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）时，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。

然后将蛋白质转移到膜上，继而用抗体进行检测经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分二、实验材料诱导与未诱导的带有口蹄疫病毒保护性抗原VP1与LTB融合蛋白基因的工程菌三、仪器、耗材与试剂（一）仪器、耗材DYY—6C电泳仪、DYCZ—24D垂直板电泳槽、封口机、DYCP—40C半干式转移电泳槽、5ml、1ml、200卩I、50卩I、10卩I移液器及相应的Tip、50ml烧杯新华滤纸、PVDF膜剪刀、刀片，直尺、铅笔、一次性手套1. （二）试剂30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O,37OC溶解,定容至100mI,棕色瓶存于4OC2. 1.5MTris-HCI（pH8.8）:Tris18.17g力口ddH2O溶解，浓盐酸调pH至8.8,定容至100ml3. 1MTris-HCl（pH6.8）:Tris12.11g力口ddH2O溶解,浓盐酸调pH至6.8，定容至100ml。

4. 10%SDS:电泳级SDS10.0g加ddH2O68C助溶，浓盐酸调至pH7.2,定容至100ml5. 10电泳缓冲液（pH8.3）:Tris3.02g，甘氨酸18.8g,10%SDS10ml力口ddHzO溶解，定容至100ml6. 10%过硫酸铵（AP）:1gAP加ddH2O至10ml7. 14.4-97.4kDa低分子量蛋白质标准（Marker）2SDS电泳上样缓冲液：1MTris-HCl（pH6.8）2.5ml,-巯基乙醇1.0ml,SDS0.6g,甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O3.5ml8. 考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25g,甲醇225ml，冰醋酸46ml,ddH2O225ml9. 脱色液：甲醇、冰醋酸、ddH2O以3：1：6配制而成10. 转膜缓冲液：48mMTris-Cl,39mM甘氨酸、0.037%SDS、20%的甲醇，pH8.3甘氨酸2.9g;Tris5.8g;SDS0.37g;甲醇200ml;力口ddH2O定容至1000ml11. 0.01MPBS（pH7.4）:NaCI8.0g;KCI0.2g;Na2HPO41.44g;KH2PO40.24g;加ddH20至1000ml显色液：DAB6.0mg;0.01MPBS10.0ml;硫酸镍胺0.1ml;H2O21.0卩I。

或增强型HRP－DAB底物显色剂盒FMDV阳性猪血清兔抗猪IgG-HRP酶酶结合物（俗称酶标抗体），购自Sigma公司，产品编号A5670四、操作步骤（一）SDS－PAGE先安装好DYCZ－24D垂直板电泳槽，然后如下操作1、聚丙烯酰胺凝胶的配制①分离胶（15%）的配制:ddH2O2.3ml10%SDS0.1ml30%储备胶5.0ml10%AP0.1ml1.5MTris-HCl2.5mlTEMED4lDYCZ－24D电泳槽1cm）然后，再在丙小心将上述溶液混匀，注意摇起气泡迅速将丙烯酰胺溶液灌注到的两玻璃板的间隙中，留出灌注积层胶所需的空间（梳子的齿长再加烯酰胺溶液上小心要覆盖一层水（可灌满）将电泳槽垂直放置于室温下分离胶聚合完全（约30分钟），将分离胶上的水倒去,并将残存的水珠用滤纸条吸去②积层胶（5%）的配制：ddH2O1.4ml10%SDS0.02ml30%储备胶0.33ml10%AP0.02ml1MTris-HCl0.25mlTEMED2卩l将上述混合液灌注到分离胶上面的两玻璃板的间隙中,并立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需30min2、样品处理：将样品加入等量的2XSDS上样缓冲液，100C加热3-5min，离心12000gX1min，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS低分子量蛋白标准品作平行处理。

3、上样：取10卩l诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中，并加入20卩l低分子量蛋白标准品作对照4、电泳:在电泳槽中加入1电泳缓冲液，连接电源，电泳时，积层胶电压60V,分离胶电压100V,电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止（约需3hr）5、染色:将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，室温4hr6、脱色：将胶从染色液中取出，放入脱色液中，多次脱色至蛋白带清晰7、凝胶摄像和保存：在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，结果存于软盘中，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中SDS—PAGE注意事项1、实验样品孔与各对照孔所加总蛋白含量要相等：2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10%APS在一周内使用室温较低时，TEMED的量可加倍3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护二）电转移1、电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5minx3次2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的6张滤纸和PVDF膜，将膜在甲醇中浸泡15秒，然后再在蒸馏水中浸泡2min，最后在转膜缓冲液中最少平衡5min3、转膜：转膜装置从下至上依次按阴极碳板、3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸、阳极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、PVDF膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。

接通电源，恒流1mA/cm2，转移1.0hr或3mA/cm2，转移30min三）免疫反应：1、用0.01MPBST洗膜（pH7.4,0.02%吐温20）,5minx3次2、封闭：将纤维素膜置于一塑料袋中，加封闭液（1%BSA于PBS（pH7.4）中，0.02%吐温20）,室温下轻轻振荡2-3小时或4C过夜3、封闭液，用0.01MPBS洗膜，5minx3次4、力口FMDV阳性猪血清，用PBS稀释50倍，37C作用2hr4、加入抗猪酶标抗体（按合适稀释比例用0.01MPBS稀释，液体必须覆盖膜的全部），4C放置12hr或37C,1hr5、将膜从酶标抗体液中取出，用0.01MPBST洗膜，5minx3次6、加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应或按试剂盒说明书进行注意事项1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件2、显色液必须新鲜配置使用，最后加入H2O23、DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细五、结果观察ABCDEFA:未诱导的工程菌（对照）B:诱导的工程菌C:诱导工程菌的包涵体D:Marker,从上至下分子量分别是94.4、66.2、43、31、20.1、14.4kDaE:诱导工程菌的免疫印迹F:未诱导工程菌的免疫印迹（对照）上图左侧A、B、C为SDS—PAGE结果，右侧E、F为印迹，B、C与A相比较，在约40kDa处有明显的蛋白条带，而E在相应的相位有阳性染色，而F却没有，说明该分子量大约40kDa的蛋白质分子是FMDV特异性。