高压氧对脑外伤大鼠海马神经元凋亡的影响.pdf

华中科技大学 硕士学位论文 高压氧对脑外伤大鼠海马神经元凋亡的影响 姓名：陈静 申请学位级别：硕士 专业：康复医学与理疗学 指导教师：尤春景 20070501 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1 高压氧对脑外伤大鼠海马神经元凋亡的影响 高压氧对脑外伤大鼠海马神经元凋亡的影响 研究生：陈 静 导 师：尤春景 教授 摘 要 摘 要 目的：目的： 通过观察脑外伤后高压氧治疗对大鼠海马神经元凋亡及Bcl-2、Bax表达的影响， 从分子水平上，研究高压氧治疗对于脑外伤大鼠神经元的保护作用 方法： 方法： 采用改良Feeney[1]自由落体法建立脑外伤模型，将72只体重在250g～350g范围内 的大鼠随机分为正常对照组（1组） 、脑外伤组（2组） 、高压氧治疗组（3组） 各组 大鼠分别在伤后1d、7d、24d处死经断头取脑后，采用TUNEL法和免疫组化方法观察 3组大鼠海马神经元的凋亡情况及Bcl-2、Bax蛋白表达情况 结果： 结果： 正常对照组TUNEL染色各时间点有微量表达，Bcl-2、Bax各时间点均有微量表达。

高压氧治疗组伤后1d、7d、24d细胞凋亡率分别为(20.2±2.5)％、(23.7±2.4)％、 (17.9±1.7)％，低于脑外伤组的(28.4±3.7)％、(36.9±3.5)％、(20.8±2.6)％高压 氧治疗组大鼠各时间点免疫组化染色Bcl-2阳性细胞率分别为（24.1±1.8）％、 （20.5±2.3）％、 （19.7±1.6）％，高于脑外伤组的（19.3±1.4）％、 （16.7±2.0）％、 （15.4±1.8）％高压氧治疗组大鼠各时间点免疫组化染色Bax阳性细胞率分别为 （30.8±2.7）％、 （26.5±1.8）％、 （18.9±1.2）％，低于脑外伤组的（45.6±5.2）％、 （48.2±3.3）％、 （32.4±1.3）％ 结论：结论： 大鼠颅脑外伤后海马神经元出现延迟性死亡，即神经元凋亡 而高压氧治疗可 通过明显提高Bcl-2的表达，抑制Bax的表达，进而抑制细胞凋亡，改善脑外伤大鼠的 预后这或许就是高压氧治疗脑外伤的分子机制之一 关键词关键词： 高压氧； 颅脑外伤； Bcl-2； Bax 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 The Study on Protective Effect of Hyperbaric oxygen therapy on Neuron Apoptosis、、Expressions of Bcl-2 and Bax-Protein in Rats with Traumatic Brain Injury Master candidate: CHEN Jing Supervisor: YOU Chun Jing. Department of Rehabilitation Medicine, TongJi Hospital, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China Abstract Objective：： To study the protective effects of hyperbaric oxygen therapy on cerebral neurons affected by traumatic injury and investigate its mechanisms in attenuating neuron apoptosis after traumatic brain damage. Methods: The traumatic brain injury model was established according to Feeney’s[1] method.72 rats were randomly assigned to model group (group 1), traumatic brain injury group (group 2) and traumatic brain injury treated with hyperbaric oxygen group (group 3). The rats in group 3 were put into hyperbaric oxygen chamber within 2 hours after the damage and were treated with hyperbaric oxygen for straight 24 days. During the process, observations were carried out in each group 1 d, 7 d, 21 d after the operation: TUNEL method was used to examine the distribution of apoptosis cells, immunohistochemical method was used to examine the distribution of Bcl-2 and Bax immunoreactive-positive cells in the brain tissues. Results: Both the average percentages of apoptosis cells and Bcl-2 immunoreactive-positive 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 3 cells in group 3 were lower than those of group 2 at each watchtime. And there was also a significant difference of the Bax immunoreactive-positive cells between group 2 and group 3. Conclusion: Hyperbaric oxygen therapy could significantly protect neurons against apoptosis after traumatic brain injury. Modulating the expressions of proteins Bcl-2 and Bax related with apoptosis may explain the protective mechanisms of hyperbaric oxygen therapy on traumatic brain injury. And early HBO application will be more beneficial for the rats with traumatic injury. Key words: Hyperbaric oxygen therapy； Traumatic brain injury； Bcl-2； Bax 独创性声明 独创性声明 本人郑重声明， 本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果的总结。

尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果 对本文的研究做出贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切 法律后果 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅 本人授权华 中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文 保密□ ，在_____年解密后适用本授权书 本论文属于 不保密□ （请在以上方框内打“√” ） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 4 前 言 前 言 颅脑外伤是死亡率及致残率极高的意外损伤，对患者、家庭和社会带来了巨大的 灾难 资料显示, 高压氧治疗对于颅脑外伤后病人的康复疗效确切。

本研究试图通过 高压氧对颅脑外伤后大鼠进行干预, 在不同时间点检测其海马神经元的凋亡情况和 Bcl-2、Bax的表达情况, 从而从分子水平探讨高压氧对颅脑外伤的治疗作用及机制 目前认为，颅脑外伤通过多种机制导致神经元损伤，坏死和凋亡是其中两种主要 的形式[2,3]神经元坏死对颅脑外伤引起的损伤反应快，在致伤后迅速出现而凋亡是 一种由基因控制的细胞主动性死亡过程，需要合成新的蛋白质，以DNA的早期降解为 特征，多表现为迟发性神经元死亡自从1972年Kerr等[4] 首次提出“细胞凋亡”的概 念以来，凋亡一直是医学界研究的热点凋亡具有独特的形态学及生化特征，包括细 胞固缩，染色质浓聚，凋亡小体形成，DNA电泳成梯状条带等因此应用专门的染色 方法，可以对凋亡细胞进行形态学观察，并进行定性和定量分析 Bcl-2家族是一系列与凋亡抑制因子Bcl-2蛋白结构类似的蛋白质，包括促凋亡及 抗凋亡机制分子，现已发现了至少30个成员最先在人类B淋巴细胞瘤染色体中发现 的Bcl-2编码癌基因蛋白[5,6]，是该家族中抗细胞凋亡成员的代表，其具有稳定线粒体 膜的功能， 能阻止线粒体释放促凋亡因子， 从而保持线粒体内膜跨膜电位的稳定。

Bcl-2 家族中另一成员Bcl-xl蛋白也有类似作用而Bax、Bik、Bid、Bad等促凋亡蛋白常位 于细胞质、细胞骨架中，当其接受凋亡信号刺激后，可发生构形改变，使凋亡信号与 其下游目标整合，传递凋亡信号进入线粒体外膜，从而启动凋亡过程的发生Bcl-2 家族蛋白通过多种机制与线粒体相关信号作用来调节细胞的凋亡，最重要的是介导释 放细胞色素C至胞浆另有研究发现，颅脑外伤后出现脑组织缺氧，神经元线粒体中 ATP含量明显下降、线粒体呼吸功能障碍亦可诱导神经元凋亡Richter等[7]认为凋亡 时细胞内ADP/ATP比值是决定细胞存活或凋亡的关键因素， 即大于0.2时细胞将发生凋 亡；反之，细胞将存活而Ankarcrona等[8]研究表明，细胞内25％～70％的ATP耗竭时 细胞将发生凋亡，ATP消耗大于70％时即发生坏死 大量文献报道，脑缺血缺氧、脑缺血后再灌注、不同程度的脑外伤（局灶性或 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 5 弥漫性）等各种类型的脑损伤均会造成迟发性神经元死亡也有相当多的实验对各种 介入方法影响脑损伤后神经元凋亡的机制进行了研究。

其中，针刺、亚低温、缺血预 处理及各种药物（促红细胞生成素、N-乙酰－L－半胱氨酸、阿司匹林、银杏叶提取 物、当归、褐藻糖胶）等均有抗凋亡作用；而睡眠剥夺、缺血再灌注等有促进细胞凋 亡的作用国内外亦有相关报道，证实颅脑外伤后存在神经元凋亡[9 ～13]凋亡细胞除 了分布于伤灶与正常组织交界的皮层，还分布在海马、齿状回、丘脑等[2,14~16] 因此 研究高压氧这一治疗手段对于颅脑外伤后细胞凋亡的影响，将有助于进一步认识高压 氧对于脑外伤的治疗机制 有国外学者[17]对高压氧治疗后患者颈动脉的中 PaO2 的变化情况进行了观察，发 现在高压氧介。