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第5章基因工程基本流程——筛选与鉴定1. 抗抗药性性筛选法法pBR322质粒上有两粒上有两个抗生素抗性个抗生素抗性基因基因: Tetr和和Ampr Tetr上有插入位点上有插入位点BamH I和和Sal I; Ampr上有插入位点上有插入位点Pst I基于基于载体体遗传标记的的筛选与与鉴定定 原理：原理：234（（1）四）四环素：素：（（2）氨）氨苄青霉素抗性基因：青霉素抗性基因：pBR322抗生素抗生素标记选择产生生 -内内酰胺胺酶酶，使氨，使氨苄青霉素青霉素转变为青霉青霉酮酸，使碘酸，使碘-青霉素指示液（青霉素指示液（I2-KI-Ampicillin））（（蓝灰色）褪色灰色）褪色抑制抑制细菌生菌生长，但不，但不杀死死细菌杀死生死生长的的细菌，但不菌，但不杀死停止生死停止生长的的细菌3））环丝氨酸：氨酸：5选择过程程如果在如果在Tetr上插入外源上插入外源DNA，，导致四致四环素抗性素抗性基因失活，可用基因失活，可用四四环素加素加环丝氨酸氨酸平板培养平板培养基基选择重重组克隆Tetr失活的菌生失活的菌生长被四被四环素抑制，不被素抑制，不被环丝氨酸氨酸杀死，保留下来；死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四不失活的菌抗四环素，能分裂生素，能分裂生长，反而，反而被被环丝氨酸氨酸杀死。

死1）四）四环素抗性插入失活素抗性插入失活6无无环丝氨酸培养基氨酸培养基7（（2）氨）氨苄青霉素抗性插入失活青霉素抗性插入失活选择过程程如果如果Ampr上插入外源上插入外源DNA，，导致氨致氨苄青霉素青霉素抗性基因失活，可用碘抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液青霉素指示液选择82.  -半乳糖苷半乳糖苷酶酶显色反色反应筛选法法 -半乳糖苷半乳糖苷酶酶 乳糖乳糖半乳糖半乳糖葡萄糖葡萄糖X-gal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛靛蓝++深深蓝色色原理原理载体体上上有有一一段段 -半半乳乳糖糖苷苷酶酶基基因因（（Lac Z））的的 片片段段（（氨氨基基端端）），其上有外源，其上有外源DNA的插入位点的插入位点 受受体体菌菌基基因因组中中有有突突变的的 -半半乳乳糖糖苷苷酶酶基基因因（（ 片片段段缺缺失失））可可以以被被IPTG诱导表表达达 载体体和和受受体体菌菌基基因因组可可以以互互补形形成成完完整有功能的整有功能的 -半乳糖苷半乳糖苷酶酶9选择过程程10 -半乳糖苷半乳糖苷酶酶使使X-gal分解成分解成蓝色色产物113. 营养缺陷型养缺陷型筛选法法原理原理载体体能能够合成某些生合成某些生长必必须营养成分，养成分，受体菌基因突受体菌基因突变不能合成不能合成这种生种生长必必须的的营养物养物质。

在在缺缺少少该营养养物物质的的培培养养板板上上涂涂布布细菌菌，，长出出的的菌菌落落均含有均含有载体的，是否重体的，是否重组子需子需进行第二行第二轮筛选12选择过程程营养缺陷型受体营养缺陷型受体营养合成型载体营养合成型载体134. 噬菌斑噬菌斑筛选法法原理原理以以λ-DNA为载体体的的重重组DNA分分子子经体体外外包包装装后后转染染受受体，体，转化子在培养板上形成噬菌斑化子在培养板上形成噬菌斑取代型取代型载体，噬菌斑即体，噬菌斑即为重重组子；子；插入型插入型载体需体需进行二次行二次选择14选择过程程15基于克隆片段序列的筛选与鉴定基于克隆片段序列的筛选与鉴定1. PCR鉴定法定法 原理：原理：针对已已知知目目的的片片段段特特异异性性扩增增包包括括：：区区分分重重组子子与与非非重重组子子、、期期望望重重组子子与与非非期期望望重重组子子、、目目的片段是否整合在受体基因的片段是否整合在受体基因组上PCR鉴定法不适用于大定法不适用于大规模模转化子的化子的鉴定16选择过程程1）从重）从重组克隆中提取克隆中提取质粒（或基因粒（或基因组DNA））2）用相）用相应引物引物进行行PCR反反应3））电泳泳PCR产物物4））检查是否有是否有PCR产物物5））PCR产物的物的长度是否与外源基因一致度是否与外源基因一致原理原理图p58172. Southern blot杂交交 原理：原理：从从宿宿主主细胞胞中中提提取取DNA（（或或质粒粒载体体）），，再再用用特特异异性性探探针（（与与目目的的基基因因同同源源））进行行核核酸酸杂交交。

只只有有带有有插插入入片片断断的的重重组载体体才才能能与与探探针杂交交，，在在底片上曝光底片上曝光显示18选择过程程Southern blot流程流程193. 菌落菌落/噬菌斑原位噬菌斑原位杂交交 原理：原理：特异性探特异性探针（与目的基因同源）（与目的基因同源）进行的核酸行的核酸原位原位杂交交20探针的制备及标记，探针的制备及标记，p60选择过程程214. R-环检测法法 原理：原理：DNA-RNA杂交：交：外源基因的外源基因的mRNA与重与重组载体体杂交交22选择过程程在在70%甲酰胺中，把甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的双链变性，复性的时候，时候，DNA-RNA杂交分子比杂交分子比DNA-DNA双双链更稳定电镜下可见一种链更稳定电镜下可见一种R-环形结构环形结构23缺点：需要缺点：需要电镜245. Northern blotting 原理：原理：从从宿宿主主细胞胞中中提提取取RNA，再用探，再用探针杂交主主要要检测插插入入片片断断是是否否被被转录检测表达表达载体25选择过程程Northern blot流程流程266. 直接直接电泳泳检测 原理：原理：有插入片段的重有插入片段的重组载体分子量比野生型体分子量比野生型载体分子量大体分子量大27选择过程程从转化后的从转化后的菌体克隆中菌体克隆中分离质粒，分离质粒，电泳、比较电泳、比较其分子量。

其分子量分子量分子量 Marker载体体重重组克隆克隆287. 限制性限制性酶酶切切图谱法法限制性限制性酶酶切切图谱：核酸：核酸经限制性内切限制性内切酶酶消化成片段，用消化成片段，用电泳方法分离，不同的核酸形成的各自独特的条泳方法分离，不同的核酸形成的各自独特的条带图谱29在外源片段大小及限制性在外源片段大小及限制性酶酶切切图谱已知的条件下，已知的条件下，选择一两种内切一两种内切酶酶切割切割载体，体，电泳后比泳后比较电泳泳结果果(DNA条条带数目和分子大小）差异数目和分子大小）差异进行区分或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果断，电泳后比较结果是否符合预计的结果 原理：原理：30ABA或或B31不同克隆的不同克隆的酶酶切切结果果32选择过程程338. DNA序列序列测定定 原理：原理：通通过对插入片段序列的插入片段序列的测定确定是否是所需的重定确定是否是所需的重组子子34选择过程程双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法化学降解法化学降解法焦磷酸降解法焦磷酸降解法高通量高通量Solexa测序测序……3536基于外源基因表达产物的筛选与鉴定基于外源基因表达产物的筛选与鉴定1. 蛋白蛋白质功能功能检测 原理：原理：外外源源基基因因编码具具有有特特殊殊功功能能的的酶酶或或活活性性蛋蛋白白，，根根据据抗抗原原抗抗体体反反应原原理理，，针对该表表达达产物物设计相相应的的检测方案方案针对表达表达载体的体的检测方法方法37待待测基因基因 产物蛋白物蛋白一抗一抗二抗二抗125I 标记的二的二 抗抗结合蛋白合蛋白固相支固相支持持滤膜膜待待测基因基因 产物蛋白物蛋白一抗一抗125I标记的二抗的二抗固相支固相支持持滤膜膜待待测基因基因 产物蛋白物蛋白一抗一抗固相支固相支持持滤膜膜固相支固相支持持滤膜膜待待测基因基因 产物蛋白物蛋白一抗一抗二抗二抗125I 标记的二抗的二抗 结合蛋白合蛋白125I标记的二抗的二抗38选择过程程1)弥弥补缺陷缺陷转化化进来的外源基因来的外源基因产物能物能够弥弥补受体菌受体菌株的突株的突变型缺陷。

型缺陷his-his+受体菌：受体菌：外源基因：外源基因：在不含在不含组氨酸的培氨酸的培养基中生养基中生长39例：小鼠的二例：小鼠的二氢叶酸叶酸还原原酶酶（（DHFR））对三甲氧三甲氧苄二氨二氨嘧啶有抗性DHFR载体体连接接转化受化受体菌体菌三甲氧三甲氧苄二氨二氨嘧啶培养基平板培养基平板含含DHFR的克隆才能生的克隆才能生长2) 增加新性状增加新性状使被使被转化的受体菌表化的受体菌表现出外源基因的表型出外源基因的表型403) 酶酶活性活性检测针对外源基因表达外源基因表达产物是物是酶酶①①扩散免疫沉淀散免疫沉淀检测分泌型分泌型产物物原理：抗原原理：抗原——抗体凝集反抗体凝集反应方方法法：：把把非非放放射射性性抗抗体体加加到到平平板板培培养养基基中中，，当当插插入入基基因因的的表表达达产物物被被细菌菌分分泌泌到到菌菌落落周周围时，，就会与抗体反就会与抗体反应形成形成“沉淀圈沉淀圈”对于不能被分泌到菌体外的蛋白于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先可先进行原位行原位溶菌溶菌处理（溶菌理（溶菌酶酶、原噬菌体、原噬菌体诱发）4243②②酶酶联免疫吸附免疫吸附测定（定（ELISA））原理：原理：一抗（一抗（primary antibody）：与目）：与目标分子的特异分子的特异结合。

合 二抗（二抗（secondary antibody）：）： 与一抗的特异性与一抗的特异性结合 酶酶连（（enzyme-linked）二抗：）二抗： 携携带能催化无色底物能催化无色底物转变为有色物有色物质（或（或发光）的光）的酶酶，再，再通通过比色比色测定有色物定有色物质的含量（或光的含量（或光强强度），从而推度），从而推测目目标分子的含量分子的含量44待待测基因基因 产物蛋白物蛋白一抗一抗二抗二抗酶酶 待待测基因基因 产物蛋白物蛋白一抗一抗二抗二抗无色的底物无色的底物有色的有色的产物物比色比色观察察酶酶 45方法：方法：固定固定样品品一抗一抗结合合二抗二抗结合合显色色/发光反光反应比色比色2. 放射免疫原位放射免疫原位检测利用抗体作利用抗体作为“探探针”原位原位检测转入受体菌并且入受体菌并且表达出相表达出相应的蛋白的蛋白质的外源基因的外源基因蛋白蛋白——蛋白蛋白杂交交 原理：原理：46选择过程程473. western blotting蛋白蛋白——蛋白蛋白杂交交 原理：原理：48选择过程程western blot过程程多抗多抗Blotting结果果单抗抗blotting结果果494. 蛋白凝胶蛋白凝胶电泳泳待待筛选克隆与非重克隆与非重组子同子同时进行蛋白行蛋白质电泳，泳，电泳泳结束后通束后通过染色染色对比相比相应条条带辨辨识重重组子。

适合受子适合受体蛋白表达种体蛋白表达种类较少，外源基因高效表达的体系少，外源基因高效表达的体系 原理：原理：5051选择过程程SDS-PAGE，染色，染色不适于不适于筛选5.转译筛选法法 借助无借助无细胞翻胞翻译系系统，通，通过表达或抑制所表达或抑制所选择的克的克隆隆载体上的外源基因的体上的外源基因的转录，来，来筛选其其产物是否符物是否符合合预期适用于期适用于mRNA转录丰度高的外源基因丰度高的外源基因 原理：原理：5253选择过程程mRNA无无细胞翻胞翻译系系统35S标记的的 甲硫氨酸甲硫氨酸翻翻译35S标记的的肽链PAGE电泳泳放射自放射自显影影比比较放射性放射性 带纹的位置的位置载体体+外源外源DNA转录与与预期期的的产物物分分子量相符？子量相符？6. DNA-蛋白蛋白质相互作用相互作用筛选检测能同能同DNA特异特异结合的蛋白合的蛋白质因子ChIP 、、EMSA、甲基化干、甲基化干扰实验……5455待待测蛋白蛋白质硝硝 酸酸 纤 维 素素 滤 膜膜能与蛋白能与蛋白质结 合的合的DNA序列序列放射性放射性标记待待测蛋白蛋白质硝硝 酸酸 纤 维 素素 滤 膜膜能与蛋白能与蛋白质结 合的合的DNA序列序列放射性放射性标记 原理：原理：一般克隆与一般克隆与筛选策略策略56。