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肿瘤分子诊断服务介绍,,,,,,,2,标准化用药,个体化用药,标准化用药,,个体化用药,标准疗法1,标准疗法2,标准疗法3,,,,,,,肿瘤药物与相关靶标,,,4,如何实现个体化用药？,分子分型 药物疗效,,,,体细胞基因突变检测,,mRNA表达检测,循环肿瘤细胞（CTC)检测,基因多态性检测,体细胞基因突变检测,,EGFR, K-RAS, B-RAF，C-KIT,1、基因突变检测技术,,8,—— qPCR-HRM（可用于血浆标本检测）—— Taqman-ARMS（与国际获批的技术相当）—— DNA测序（基因突变检测的金标准技术）,突变检测技术之一 Taqman-ARMS,,9,所有定量PCR仪均可使用主要用于各类组织，包括手术、穿刺或镜检组织类2小时即可完成检测试剂盒商业化程度高，临床认可程度高国内已有试剂盒获批SFDA,突变检测技术之一 qPCR-HRM,,10,qPCR-HRM技术是基于高效稳健的PCR上的高分辨熔解曲线分析（High-Resolution Melting）技术，灵敏度可以达到1%-0.1%，既能检测已知突变，也能检测未知突变qPCR-HRM的突变检测已获国际多中心双盲实验验证（Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 11, No. 6, November 2009）。

实例图：利用HRM技术对7个样本分别进行EGFR（左图）、KRAS（右图）突变检测，红色表示该样本发生突变，蓝色表示未突变，蓝色横直线为阴性对照左图显示2个样本发生了EGFR突变；右图显示4个样本发生了KRAS突变EGFR,KRAS,,,11,血浆EGFR突变检测：18号外显子：无突变 19号外显子：突变 20号外显子：无突变 21号外显子：无突变附图,,,主要特点：实现血浆中来自肿瘤的微量DNA的突变检测目前所做的临床实验中，血浆EGFR检测结果与其手术标本之间的整体符合率符合率达到91.25%是临床上不能手术、也同时不愿穿刺患者的替代检测方案；也可 获得性耐药进行预先检测qPCR-HRM用于血浆微量突变检测,,国际公认的分子检测金标准有明确的物价收费实验流程较复杂，需要大型仪器,突变检测技术之一 DNA测序,,,突变检测项目列举,,EGFR突变检测,EGFR E19 / E21敏感突变适合使用TKI药物治疗,,耐药位点检测T790M,,,K-RAS突变检测,,,BRAF,NCCN,,2010年NCCN《结直肠癌临床实践指南》指出：K-ras基因为野生型而同时具有BRAF V600E突变的患者，靶向EGFR抗体治疗无效。

BRAF-V600E检测,肿瘤学临床实践指南（中国版） 2010第一版,指导肿瘤靶向治疗的靶标,,基因多态性检测与药物代谢毒性 (UGT1A1,CYP,DPD),,,,,2018/9/6,19,单核苷酸多态性（SNP）是最常见的基因变异,至少1%的人群,绝大多数人群,共有序列,G to C,SNP位点,变异的序列,,,最常见的基因多态性 SNP,,,2018/9/6,20,,为什么 SNPs 重要?,个体 1,个体 2,= SNP variations in DNA,SNP标志基因 A,基因 B,基因 A,SNP 可能使基因 B 产生变异的蛋白质分子,,,2018/9/6,21,个体的SNP 谱,SNP 谱A,SNP 谱B,SNP 谱C,SNP 谱F,SNP 谱E,SNP 谱D,,,2018/9/6,22,SNP 谱有助于确定药物的疗效和副作用,乳腺癌病人,个体的SNP 谱可以分成不同的类型,SNP 谱 A,对药物有期望的反应,,,对药物没有期望的反应,,SNP 谱 A 的人对药物 有期望的反应,SNP 谱E,SNP 谱 B,SNP 谱 C,SNP 谱D,,,药物代谢与SNP检测,化疗药物在体内经过吸收、代谢、分布和清除，通过其活性物质对治疗靶点的直接攻击而发挥作用，整个过程需要多种蛋白质/酶的共同参与和协同作用。

SNP 主要是指在基因组水平上变异频率大于1%的单核苷酸变异所引起的DNA序列多态性，多态性会导致不同个体体内各种蛋白，酶活性的差异，因此导致药物使用情况的不同胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因（UGT1A1）,UGT1A1*27(C686A)或UGT1A1*28[(TA)7TAA]:野生型：6个TAUGT1A1*6(G211A)：,使UGT1A1的转录活性下降了三分之二 导致对伊立替康的毒性增加FDA提示：UGT1A1的多态性-伊立替康的毒性增加(6TA),此型的酶活性是野生型的49％ CYP19A1 多态性影响芳香化酶抑制剂疗效,,25,CYP19A1是芳香化酶的编码基因，临床研究已证实有着很大的影响作用在接受芳香化酶抑制剂治疗的乳腺癌患者中，携带CYP19A1基因rs4646（G>T）突变患者的治疗效果较无此突变的患者显著2-4（下图）CYP19A1 rs4646（G>T）SNP是乳腺癌患者接受芳香化酶抑制剂治疗疗效的有效预测指标如图一项对乳腺癌患者的临床研究显示：CYP19A1基因rs4646突变的患者使用芳香化酶抑制剂药物疗效明显优于野生型患者（p<0.0001）1参考文献 1. Ian ES et al. N Engl J Med. 2003;384:2431-42. 2. Ramon C et al. Clin Cancer Res. 2008;14:811-6. 3. Lunardi G et al. J Clin Oncol. 2009; 27: 555. 4. Fasching PA et al. Breast Cancer Res Tr. 2008;112:89-98.,基因表达检测（mRNA表达） (ERCC1\BRCA1\TUBB3\TS),,,基因表达检测指标（靶向药物）,,28,HER2基因表达检测,采用RT-PCR方法替代FISH或免疫组化方法，临床准确率达97%以上。

主要特点： 客观，不用人为观察 时间短，整个检测60分钟左右完成 高通量，一次可以检测6人份PDGFRα 低表达患者的无进展生存期和总生存期明显长于高表达患者,,,,,化疗药物与检测靶标,,ERCC1表达与铂类药物疗效相关的临床数据,ERCC1阴性患者，能从铂类辅助化疗中获益.,,,BRCA1/2表达与铂类药物疗效相关的临床数据,BRCA1过度表达铂类耐药的预测因子抗微管类药物的敏感因子,,,,,34,低TS mRNA水平的肿瘤患者接受氟类化疗的效果较好，中位生存期较长TS低表达的患者对培美曲赛的疗效好TS高表达影响氟类和培美曲塞药效,Shirota Y et al. J Clin Oncol. 2001;19:4298-304,化疗药物与检测靶标,,小 结,,NSCLC个体化用药系统方案,,,遗传性非息肉性结直肠癌（HNPCC)是由DNA错配修复基因（MMR)发生基因突变导致的一种单基因的显性遗传疾病，又称lynch综合症，发生基因异常的个体其患发结直肠癌的风险约为60%HNPCC实验室检测流程,,,1 背景介绍之HNPCC与MMR MSI,目前已发现的导致人类HNPCC发生的MMR有MSH2、MLH1、MSH6、PMS1、PMS2，其中MSH2和MLH1基因的功能最重要，其突变占已发现突变的90%左右。

39,1 背景介绍之HNPCC与MMR MSI,研究显示， 约有86%-95%的HNPCC具有MSI特征， 而散发型大肠癌中只有16% MSI所产生的遗传不稳定性将加速恶性肿瘤的发生 1997年美国NCI (national cancer institution)将MSI确定为检测和筛选HNPCC的重要方法之一，并推荐将BAT26、BAT25、D2S123、D5S346和D17S250 5个位点作为检测HNPCC的位点40,实验室检测流程,,,HNPCC检测项目,,标本要求,,肿瘤在变,“We can look at tumors for changes at the DNA, RNA and protein levels. It certainly gives us a way of looking at what is happening inside a tumor, and that's very exciting.“ Dr. Gordon Mills Chair Systems Biology MD Anderson Cancer Center Houston, Tx As reported in “The Cancer Test” – TIME (June 14, 2007), Aust Med J，Ashworth最早在转移性癌症患者血液中观察到。

2005年 N Engl J Med，Cristofanilli证实治疗前CTC数目是转移性乳腺癌患者无进展生存期和总生存期的独立预测因子循环肿瘤细胞指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞获取CTC需要解决的技术问题,从红细胞和白细胞中富集恶性肿瘤细胞 将恶性肿瘤细胞与红细胞、白细胞、正常上皮细胞、造血干细胞等区分开来,每10mL血液中可能仅含有几个到几十个循环肿瘤细胞，而10mL血液中含有的白细胞约有1亿个，红细胞有500亿个三种技术,过滤法,ISET: Isolation by Size of Epithelial Tumor cells 8μm孔径过滤膜，漏检体积较小的肿瘤细胞 敏感性低,梯度密度法,肿瘤细胞和单核细胞密度小于1.077g/ml CTC纯度低，混入较多白细胞 肿瘤细胞会迁移至血浆层，而聚集后容易下沉 聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)对细胞有毒性,免疫磁珠法,肿瘤细胞表面抗原EpCAM与包绕着磁珠的特异性单抗相结合 CellSearch细胞保存方法长达96小时 实验室室间差异小 EpCAM的假阳性和假阴性,CellSearch 是全球第一也是唯一经FDA批准可用于临床的循环肿瘤细胞（CTC）产品,,1983 磁流体,如何鉴别出CTC?,,CTC,Anti-EpCAM磁珠,Anti-CK-PE,Nucleus DAPI,CK,EpCAM,,在CellSearch®检测中，CTC 被设定为： EpCam CK-8,18 和/或19 DAPI CD45,+ + + -,CellSave 储存管,,CellSearch CTC检测试剂盒,CellSearch: 自动化的CTC分离、富集和计数,,磁巢Magnest,,,CellTracks Analyzer II,96小时稳定,2004年FDA批准,CTC质控试剂盒,磁力 捕获,FIRST AND ONLY,APPROVED,切点的意义——评估预后,,CTC数量变化是预后改变的重要预测,,CTC的应用：从细胞计数到分子特性,,。