蛋白质凝胶电泳.docx

蛋白质凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）,是目前对蛋白质进行分离、 纯度鉴定及分子量测定的主要方法之一十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子去污剂，可与蛋 白质结合，使蛋白质变性并带上大量负电荷SDS-PAGE是最常用的凝胶电泳技术它通常采用 不连续电泳系统，即用上层胶（成层胶）和下层胶（分离胶）两种不同浓度的凝胶灌制凝胶板 见图2.SDS-PAGE通过其电荷效应、浓缩效应和分子筛效应，达到蛋白质高分辨率的分离效果图2 SDS-PAGE凝胶分层示意图待分离蛋白质样品在电泳中的泳动速度，或相对迁移率（Mr）与蛋白质本身性质（如分子大 小）、凝胶孔径和电泳条件（如电流、电压）等密切相关，蛋白质结合大量的SDS后，各组分 之间的的形状和电荷差异被抵消，此时蛋白质在电场中泳动速度的快慢，仅与各自分子量的大小 有关因此，可根据下列公式计算分子量大小：lgMW=lgK—bMr其中，MW为蛋白质的分子量，K为常数，Mr为相对迁移率，b为斜率将已知分子量的几 种标准蛋白质在电泳中的相对迁移率对其分子量的对数做图，即可得到一条蛋白质分子量校正曲 线。

根据待测样品的相对迁移率，可由校正曲线查到其分子量大小，蛋白质样品中加SDS煮沸 后，蛋白质发生变性，为保护和还原二硫键，尚需加还原剂2-巯基乙醇（2-ME）或二硫苏糖醇（DTT ）蛋白质变性使亚基聚合形式存在的蛋白质解聚成单个亚基因此，对于一个纯化蛋白 质，可经SDS-PAGE确定其亚基种类、数目及大小上述蛋白质分子量测定更确切地说是蛋白 质分子各亚基分子量的大小丙烯酰胺凝胶孔径对电泳速度及分离效果影响很大凝胶孔径的大小取决于丙烯酰胺（Aery） 单体及N, N—亚甲基双丙烯酰胺（Bis）的含量及比例总胶浓度（T）可在3%〜30%范围内 变动，T为8%〜15%的凝胶，适用于大多数蛋白质样品的分离交联度（C）是反映凝胶聚合 情况的一个指标凝胶聚合过程中，Acry单体之间形成延伸的多聚链，并通过Bis的作用，连 接和交叉成网状结构，最终成为肉眼可见的凝胶催化剂过硫酸铵（APS ）和加速剂四甲基己二 胺（TEMED）直接影响凝胶聚合质量二者加量过多，会使Acry单体聚合链较短，聚合不充分, 胶的脆性增加；反之，如加量过少，则聚合速度大大降低，甚至只出现所配制的胶溶液黏度稍增 加、无胶状物出现的现象。

见图3.Mr图3相对迁移率与分子量对数关系简图根据电泳的目的和要求及样品的特点，可采取恒流或恒压条件进行电泳由于印迹技术需将蛋白质成功地从胶中转移至膜上，因此，选择合适的凝胶甚为重要一般情 况下，丙烯酰胺和交联剂的比例越低，转移就越易进行超薄胶转移的速度快，而且彻底通常, 应根据目的选择厚度、大小均适合的凝胶若想寻求蛋白质的最佳分辨力，长胶的效果较好，使 较大分子量的蛋白质更好地分离若想达到最大的灵敏度，胶的厚度可增加到1.5mm，并且在 不发生变形的前提下，尽量提高蛋白的上样量若主要考虑的是分离速度，则选用微型胶，厚度 为0.5mm表1显示SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围表1 SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围丙箱nt肢'楸度觀性分离范S(kD)1512-W10】卜丽7-SS6-SM57-J12。