蛋白酶的筛选.docx

蛋白酶的筛选 蛋白酶的筛选 1、取土壤，晾干，过40目筛，用无菌水梯度稀释至0.000001g土/1mL水 或0.0000001g土/1mL水，待用 2、配酪素培养基（加琼脂），高压灭菌，倒平板；配LB培养基或发酵培 养基，灭菌，分作液体培养基，另外取一些倒斜面 3、取1的融入土壤的水1mL涂平板，置于恒温箱，于50度或以上培养 1～3天，挑选有水解圈（透明圈）的菌落用来划斜面（LB），于50度或以上进行纯化培养 4、取纯化菌株，于液体LB中扩大培养 5、离心，取沉淀，盐析，透析，得酶液 6、以酪蛋白为底物，测酶液酶活，若酶活较大，则该菌株为你要的菌株 了 初筛1：用选择性培养基，把PH调低，则耐酸的才能活，另外，把N源去掉，加入酪素（酪蛋白），其他营养成分照基础培养基就行了，这样，产蛋白酶的菌种能将酪素分解成酪氨酸，就有可利用的N源，不产蛋白酶的菌种不能利用酪素，则没有N源，最后耐酸又产蛋白酶的菌种成为优势菌，挑出，换培养基。

初筛2：初筛1所得菌种用透明圈法（蛋白酶水解酪素产生透明圈，直径越大，酶活越高，具体步骤自己找）挑出蛋白酶活力高的菌种，接入摇瓶培养 复筛：初筛2所得菌以福林试剂法测酶活（以Folin染色，测吸光度，具体步骤自己找），酶活最高者为最终菌种 一、 酪素培养基 成分： 酪蛋白10g 牛肉膏3g 磷酸氢二钠2g 氯化钠5g 琼脂15g 蒸馏水1010mL 0.4%溴麝香草酚蓝溶液12.5mL pH7.4 制法：将除指示剂外的各成分混合，加热溶解(但酪蛋白不溶解)，校正pH加入指示剂，分装烧瓶，121℃高压灭菌15min临用时加热溶化琼脂，冷至50℃，倾注平板 注：将菌株划线接种于平板上，如沿菌落周围有透明圈形成，即为能水解酪蛋白 蛋白酶的筛选 1、取土壤，晾干，过40目筛，用无菌水梯度稀释至0.000001g土/1mL水 或0.0000001g土/1mL水，待用 2、配酪素培养基（加琼脂），高压灭菌，倒平板；配LB培养基或发酵培 养基，灭菌，分作液体培养基，另外取一些倒斜面。

3、取1的融入土壤的水1mL涂平板，置于恒温箱，于50度或以上培养 1～3天，挑选有水解圈（透明圈）的菌落用来划斜面（LB），于50度或以上进行纯化培养 4、取纯化菌株，于液体LB中扩大培养 5、离心，取沉淀，盐析，透析，得酶液 6、以酪蛋白为底物，测酶液酶活，若酶活较大，则该菌株为你要的菌株 了 初筛1：用选择性培养基，把PH调低，则耐酸的才能活，另外，把N源去掉，加入酪素（酪蛋白），其他营养成分照基础培养基就行了，这样，产蛋白酶的菌种能将酪素分解成酪氨酸，就有可利用的N源，不产蛋白酶的菌种不能利用酪素，则没有N源，最后耐酸又产蛋白酶的菌种成为优势菌，挑出，换培养基 初筛2：初筛1所得菌种用透明圈法（蛋白酶水解酪素产生透明圈，直径越大，酶活越高，具体步骤自己找）挑出蛋白酶活力高的菌种，接入摇瓶培养 复筛：初筛2所得菌以福林试剂法测酶活（以Folin染色，测吸光度，具体步骤自己找），酶活最高者为最终菌种 一、 酪素培养基 成分： 酪蛋白10g 牛肉膏3g 磷酸氢二钠2g 氯化钠5g 琼脂15g 蒸馏水1010mL 0.4%溴麝香草酚蓝溶液12.5mL pH7.4 制法：将除指示剂外的各成分混合，加热溶解(但酪蛋白不溶解)，校正pH。

加入指示剂，分装烧瓶，121℃高压灭菌15min临用时加热溶化琼脂，冷至50℃，倾注平板 注：将菌株划线接种于平板上，如沿菌落周围有透明圈形成，即为能水解酪蛋白。