血脂脂蛋白及载脂蛋白测定课件.ppt

第十章 血脂及血浆脂蛋白检验,第一节 概 述 第二节 血脂、脂蛋白 及载脂蛋白测定,一、血脂和血浆脂蛋白 自学 二、脂蛋白代谢紊乱 （一）高脂蛋白血症 血脂含量超过正常称为高脂血症，由于血脂均以血浆脂蛋白的形式存在，故也称为高脂蛋白血症按发病原因分为两大类 1.按表型分类 以Fredrickson（1967）分类法为基础，经WHO（1970）修订的分类系统，根据血清TC、TG、外观和脂蛋白电泳图谱，将其分为6型第一节 概 述,（1）Ⅰ型高脂蛋白血症 又称高乳糜微粒血症是一种常染色体隐性遗传病由于LPL缺损或LPL活化因子（ApoCⅡ）缺损所致婴儿期即可发生，但罕见其生化检查特征： ①4℃冷置试验，血清上层为奶油状，下层清亮 ②血清TG↑↑，达11mmol/L以上，血清TC正常或轻度↑ ③血清LPL活性↓ ④血清脂蛋白电泳，CM↑↑2）Ⅱa高脂蛋白血症 又称高β-脂蛋白血症或高胆固醇血症属常染色体显性遗传，有明显的家族史病因LPL受体缺损，杂合子型发生频率为1/500，纯合子型发生频率为1/100000其生化检查特征： ①4℃冷置试验，血清外观清亮透明 ②血清TC↑↑，＞15.6mmol/L尤其是LDL-C↑↑，TG正常。

③血清脂蛋白电泳，β-LP↑↑ 临床表现，中青年常伴有冠状动脉硬化，结局为心肌梗塞3）Ⅱb型高脂蛋白血症 在Ⅱa型基础上伴有VLDL（高LDL+VLDL血症），病因不明其生化检查特征： ①4℃冷置试验，血清外观清亮或微混 ②血清TC↑，TG↑ ③血清脂蛋白电泳，β-LP↑，preβ-LP↑4）Ⅲ型高脂蛋白血症 又称宽β-脂蛋白血症属常染色体显性遗传病，发病率1/10000，病因，ApoE异常，与相应受体结合率↓其生化检查特征： ①4℃冷置试验，血清外观混浊，后形成蜡样黄色薄膜 ②血清TC↑，TG↑ ③血清脂蛋白电泳，β-LP↑，preβ-LP↑，IDL↑融合形成宽β区带5）Ⅳ型高脂蛋白血症 又称高前β-脂蛋白血症或家族性高甘油三脂血症属常染色体显性遗传病，较常见，我国原发性高脂蛋白血症中一半属于此型病因，ApoA2异常其生化检查特征： ①4℃冷置试验，血清外观混浊 ②血清TG↑↑，TC正常或稍↑ ③血清脂蛋白电泳，preβ-LP↑ 临床表现，多见于中年人易发生冠心病6）Ⅴ型高脂蛋白血症 属常染色体显性遗传病，病因不详，可能由几种遗传缺陷所致，较罕见生化检查特征： ①4℃冷置试验，血清上层为奶油状，下层混浊。

②血清TG↑↑，TC↑ ③血清脂蛋白电泳，CM↑↑，preβ-LP↑2.按是否继发于全身性疾病分类 分为原发性和继发性高脂血症常继发于糖尿病、肝病、肾病、肥胖以及过量饮酒，成人发病率为3%～5% 3.高脂血症的基因分型法 一部分高脂血症患者存在单一或多个遗传基因的缺陷，具有明显的家族聚集性，有明显的遗传倾向二）低脂蛋白血症 主要有四种类型 1.低LDL血症 是一种常染色体显性遗传病，病因ApoB100低下，血浆LDL减少，TC↓ 2.无LDL血症 罕见的常染色体隐性遗传病，病因ApoB100、B48缺损，血浆中无LDL，TC↓↓ 3.低HDL血症 病因不详，血清TG↑，动脉粥样硬化、冠心病的发病率高 4.无HDL血症（Tangier病）罕见的常染色体隐性遗传病，ApoAⅠ、AⅡ缺损，血浆TC↓，HDL-C↓血脂测定方法很多，目前临床实验室基本检验项目有：血清外观分析，TC，TG，HDL-C，LDL-C测定进一步可做HDL亚组分，IDL，Apo（如ApoAⅠ、ApoB100），Lp（a）及脂蛋白电泳，LPL，LCAT测定，为保证分析结果的可靠性，标本的采集应在餐后12h以上第二节 血脂、脂蛋白及载脂蛋白测定,一、血清外观分析（血清冷置试验）,,,,,,,二、血清总胆固醇测定 胆固醇是人体重要的脂类成分，具有重要的生理功能，如合成类固醇激素，维生素D3胆汁酸，并构成细胞膜成分，TC包括FC（1/3）和CE（2/3），胆固醇与动脉粥样硬化有密切关系，故胆固醇测定是最常用的实验室检测项目之一。

TC测定方法很多，约200多种，分为化学测定法、酶法、气相色谱法、高效液相色谱法、核素稀释质谱法（决定性方法）一）化学测定法 主要有两类 1.Liberman-Burchard反应 简称L-B反应，胆固醇经冰醋酸，浓硫酸脱水生成3.5-胆烷二烯阳离子，然后被醋酐，浓硫酸氧化生成绿色的胆烷六烯磺酸呈色稳定性差 2.Zak反应 胆固醇经冰醋酸，浓硫酸脱水生成3.5-胆烷二烯阳离子，然后在Fe3+存在下氧化生成紫红色胆烷四烯阳离子，灵敏度较L-B反应高7倍，且呈色稳定性好，但试剂腐蚀性极大，不能用于自动化分析二）酶法 胆固醇酯 胆固醇 ＋ 脂肪酸 胆固醇 ＋ O2 胆烷-4-烯-3酮 ＋H2O2 H2O2 ＋ 4AAP ＋酚 红色亚胺醌 ＋ H2O,CEH,ChOD,POD,试剂中除上述三种酶外，还有胆酸钠和表面活性剂及稳定剂，胆酸钠用于激活CEH，表面活性剂促进胆固醇从脂蛋白中释放 酶法操作简便，快速，试剂无腐蚀性，适合于自动化分析，但也存在有一些不足，CEH对胆固醇水解不完全，表面活性剂影响CEH活性，黄疸血清中过高的胆红素可还原H2O2使结果偏低。

参考范围】3.10～5.70mmol/L 【临床意义】血清TC含量受年龄、性别、饮食和运动等因素的影响①20岁以上随年龄↑而↑，70岁以后则有下降趋势②20～40岁阶段男性高于女性，但女性绝经后则高于男性③城市人群高于农村人群，与饮食和运动有关④脑力劳动者高于体力劳动者 病理性高胆固醇血症 原发性高胆固醇血症，糖尿病、胆道阻塞、肾病综合症、甲状腺功能减退 病理性低胆固醇血症 严重贫血、甲亢、营养不良三、血清甘油三脂测定 TG是有一分子甘油与三分子脂肪酸组成的化合物，主要存在于VLDL和CM中，临床化学中往往以测定甘油代表TG的含量TG的测定方法很多，如气相色谱法、高效液相色谱法、红外分光光度法但上述方法需特殊的仪器设备和技术，故一般只用于研究工作中临床实验室主要用化学法和酶法一）化学法 基本步骤可归纳为四步 1.提取：甘油三脂的提取 采用合适的溶剂，使脂蛋白变性提取TG，同时去除干扰物质(磷脂、游离甘油、葡萄糖等),常用方法有： （1）异丙醇抽提，沸石合剂（沸石、高岭土）吸附 （2）异丙醇抽提，氧化铝吸附磷脂 （3）正壬烷、异丙醇、稀硫酸分溶抽提，免去吸附磷脂的操作，后用价廉的正庚烷代替正壬烷。

应用较广2.皂化：甘油三脂的水解 一般都采用KOH乙醇或KOH异丙醇溶液，60℃，5～15min可使TG完全水解 3.氧化：甘油的氧化 最常用的氧化剂是HIO4，甘油在酸性条件下被氧化成甲醛、甲酸反应受α-磷酸甘油、葡萄糖、丝氨酸的干扰，故抽提时应尽量除去此类物质的干扰4.显色：显色测定甲醛常用方法有： （1）甲醛与变色酸（4.5-二羟-2.7-萘二磺酸）在硫酸溶液中加热生成紫红色化合物570nm） （2）甲醛与乙酰丙酮在氨的存在下缩合成黄色的3.5-二乙酰-1.4-二氢-2.6-二甲基吡啶420nm）,（二）酶法 常用的有： 1.磷酸甘油氧化酶法（GK-GPOD-POD法） TG ＋H2O 甘油 ＋ FA 甘油 ＋ ATP 3-磷酸甘油 ＋ ADP 3-磷酸甘油 ＋ O2 磷酸二羟丙酮 ＋ H2O2 H2O2 ＋ 4-AAP ＋ 酚 红色亚胺醌 ＋ H2O 试剂较稳定，灵敏度高，线性范围宽，胆红素、维生素C可消耗H2O2使结果偏低LPL,GK,GPOD,POD,,,,,2.乳酸脱氢酶法（GK-PK-LDH 法） TG ＋ H2O 甘油 ＋ FA 甘油 ＋ ATP 3-磷酸甘油 ＋ ADP ADP ＋ 磷酸烯醇式丙酮酸 ATP ＋ 丙酮酸 丙酮酸 ＋ NADH＋H+ 乳酸 ＋ NAD+ 3.甘油氧化酶法 第一步消除血清中原有的甘油：,LPL,GPOD,PK,LDH,,,,,游离甘油 ＋ O2 甘油醛 ＋ H2O2,GlyOD,H2O2 ＋ EMAE 无色物质 EMAE称N-乙基-N-（3-甲基）-N-乙酰乙二胺。

是一种还原剂，灵敏度比酚高第二步测定甘油三脂水解释放的甘油： TG ＋H2O 甘油 ＋ FA 甘油 ＋ O2 甘油醛 ＋ H2O2 H2O2 ＋ 4-AAP ＋ EMAE 有色化合物,POD,GlyOD,LPL,POD,,,,,,【参考范围】0.56～1.70mmol/L 【临床意义】血清TG一般随年龄增长而升高，体重超标者往往偏高 1.病理性增高 原发性高脂蛋白血症、肥胖症、糖尿病、肾病综合症、脂肪肝、妊娠后期 2.病理性降低 甲亢、肾上腺皮质功能减退、严重肝功能损伤四、血清（浆）脂蛋白测定 （一）血清脂蛋白电泳 临床实验室常用的支持介质有醋酸纤维薄膜和琼脂糖凝胶 1. 血清脂蛋白醋酸纤维薄膜电泳 以醋酸纤维薄膜为支持介质，血清脂蛋白经电泳分离，然后用臭氧氧化，使脂蛋白中的不饱和脂肪酸的双键断裂生成醛，再用亚硫酸品红染色，即生成紫红色区带2. 血清脂蛋白预染琼脂糖电泳 血清脂蛋白经饱和苏丹黑B预染后，以琼脂糖凝胶为支持介质，进行电泳分离，即可得到清晰的兰色区带 凝胶浓度一般为0.5%，超过1%，β-Lp与preβ-Lp不易分开，＜0.5%，凝胶机械强度太低。

血清：染料为9：1，染料过多稀释标本，而且染料中乙醇会引起蛋白质变性，影响分离效果结果判断，直观区带的着色深浅，宽窄，用浅染，稍浅染，深染及消失加以描述；或用光密度扫描仪测定 【参考范围】 α-Lp 30%～40% preβ-Lp 13%～25% β-Lp 50%～60% CM （－）,（二）血清高密度脂蛋白测定 常以测定HDL-C含量代表HDL水平测定步骤包括①HDL的分离；②测定HDL中胆固醇 HDL的分离方法有：超速离心法、凝胶过滤法、免疫化学法、电泳法、沉淀法临床实验室常用沉淀法沉淀剂一般为二价阴离子和多价阴离子如：肝素-Mg2+、硫酸葡聚糖- Mg2+、磷钨酸- Mg2+、聚乙二醇（PEG）等如：磷钨酸- Mg2+选择性地沉淀血清中的LDL和VLDL，经离心上清液中保留HDL，然后用酶法测定上清液中的胆固醇含量，即代表HDL中的胆固醇 【参考范围】男 1.28±0.33mmol/L 女 1.37±0.33mmol/L 【临床意义】HDL-C与冠心病发病呈负相关，HDL-C低于0.9mmol/L是冠心病危险因素三）血清高密度脂蛋白亚组分测定 HDL有三个亚类（HDL1、HDL2、HDL3）最近的研究工作表明，HDL2亚类与冠心病危险度的相关程度比总HDL-C更密切。

HDL2 d = 1.063～1.125g/ml HDL3 d = 1.125～1.210g/ml HDL2脂类60% 蛋白质40% ；HDL3脂类45% 蛋白质55%,高密度脂蛋白亚组分的分析方法有超速离心法、柱层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、多价阴离子分级沉淀法 其中多价阴离子分级沉淀法具有快速、经济、简便更为实用，是目前临床实验室最常用的方法常用的沉淀剂有硫酸葡聚糖- Mg2+、聚乙二醇（PEG）原理】用PEG做沉淀剂，以不同浓度的PEG在不同pH条件下分别将VLDL和LDL（沉淀剂Ⅰ 95g/L PEG，pH6.5）HDL2（沉淀剂Ⅱ 170g/L PEG，pH7.5）沉淀，上清液中只含有HDL（沉淀剂Ⅰ）和HDL。