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分子遗传标记及其应用摘要：分子遗传标记育种是一种新兴的分子标记技术，目前已经在分子生物学特别是在分 子遗传学上得到了广泛的应用本文介绍了分子遗传标记的概念及应用 关键字：分子遗传标记，标记辅组选择Abstract：Served as an newly rising genetic marker technique,molecule genetic markers is being widely used on molecule biology,especially in molecule genetic researches. This article gives a brief introduction of the conception and utilization of molecule genetic markers. Keywords:marker assisted selection；molecule genetic markers一． 分子遗传标记技术1．1 分子遗传标记的定义DNA分子遗传标记技术是一种新兴的分子标记技术，目前已经在分子生物学特别是在 分子遗传学上得到了广泛的应用，由于真核生物的遗传信息都储存在染色体和细胞器基因组 的DNA序列中，因此从理论上讲，DNA水平上的分子标记是所有遗传标记中最为稳定，最 为可靠的。

随着现代分子生物学技术的发展，使直接利用DNA序列中核甘酸的变异作为遗 传标记成为了可能目前，对分子遗传标记较完整的描述，是指易于识别，遵循孟德尔遗传模式的，具有个 体特异性或其分布规律具有种质特征的某一类表型特征或遗传物质；其范围包括：① 基因或遗传物质的产物的变异特征；② 作为基因或遗传物质载体的染色体的形态学变异；③ 基因或遗传物质本身的变异［1］1．2 分子遗传标记的作用分子遗传标记能够在DNA水平上对编码和非编码序列的遗传变异进行检测，不受内外 环境的影响；大多数分子标记多态性的信息含量很高；而且检测迅速、方便，无组织差异 由此可见，分子遗传标记是最理想的遗传标记，这决定了它能够得到迅速的发展，并能够广 泛的应用于遗传育种研究和农牧生产的各个领域遗传标记主要有如下应用（1） 定位基因序列在染色体上的位置2） 构建遗传连锁图谱3） 定位数量性状基因座4） 对与性状相关的候选基因和主基因进行鉴定5） 对动物种群遗传资源进行评估6） 进行系谱/血缘分析7） 分类学与分子系统学研究，进行系统发育分析和绘制生物进化树，研究基因结构 和功能进化8） 胚胎的早期性别和性状诊断，为选择性坠胎术提供参照依据。

9)动物基因身份证10) 遗传性疾病或遗传缺陷的诊断与分析11) 已知病原微生物的株型(毒力)、抗性分型12) 对混合感染和继发感染疾病进行诊断与分析13) 在分子遗传流行病学中的病源鉴定，毒力进化跟踪，传播途径、速度、媒介分析 和流行规律分析14) 微生物群落的生态位检测15) 出入境病原、种质监测16) 转基因动植物上的应用17)进行药物基因学(Pharmacogenomics)研究 18)分子育种( molecular breeding )应用( 19 )器官移植中的应用1．3 分子遗传标记的发展趋势当前分子遗传标记的发展，有以下五个趋势：( 1 )对现有遗传标记技术进行优化与集成，降低检测成本，提高检测效率，组合已有 标记技术，同时提高标记的靶向性，使反映的信息专一性更加突出2)充分利用基因组结构的共性特征开发新标记，如重复序列、散在保守序列，新基 因家族，启动子保守序列等，利用基因和基因内部模块“界标”保守序列，挖掘并利用基因组 中编码元件与非编码序列的保守特征，从而发现更多更稳定、效应更显著的分子标记 3 )开发揭示新遗传变异类型的标记，如表观遗传差异，表达丰度差异，表达模式差(4) 标记开发向高通量方向发展，女如SNP芯片，变性高效液相色谱DHPLC,基质辅助 激光解吸附电离飞行时间质谱分析(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry， MALDI-TOF)等。

5) 同时揭示多层次信息的复合标记，从基因组一转录组一蛋白组一代谢组一表型组, 各层次信息的不平衡性决定了仅用单层次标记的局限性，使用多层次的标记，更能展示基因 的表达调控方法和作用1．4 分子遗传标记的主要方法随着分子生物学技术的发展，在DNA分子遗传标记中，出现了越来越多的新方法，现 选择主要方法，介绍如下：1. 4. 1 DNA限制性片段多态(RFLP)技术RFLP技术是1980年美国学者Botstein首次发现的第1代分子标记技术⑵，当核苷酸序列出 现碱基替换、插入、缺失及倒位等分子重排时，可能会导致限制性酶切位点的丢失和获得［3］， RFLP的优点主要表现在：① RFLP标记无表型效应，非常稳定，故其检测不受外界条件、性别及发育阶段的影响；② RFLP标记在等位基因间是共显性的，因此能区别纯合子和杂合子，非等位基因间则 不存在上位效应，互不干扰；③ RFLP是起源于基因组DNA的自然变异，这些变异在数量上几乎不受限制，可以选取 足够数量的代表整个基因组的RFLP标记因此，作为第一代分子标记，至今仍是使用最为 广泛分子遗传标记技术1. 4. 2 DNA扩增片段单链构象多态(PCR - SSCP)1989年，日本O rita M等⑷发现单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象。

这种立体结构主 要由其内部碱基配对等分子内相互作用来维持故当有碱基发生改变时，会或多或少地影响 其空间构象，使其分子构象发生改变因空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝 胶中前进时受到的阻力不同，会导致电泳的速度不同，经染色后就可以在凝胶上面检测出结 果，因此该方法被称为单链构象多态性(single strand comformation polymorphism， SSCP)分 析PCR-SSCP技术是把PCR技术和SSCP技术相结合，将PCR扩增产物变性后，置于碱性 非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，从而检测相应的遗传变异PCR-SSCP 分析法的优点在于：操作简单，不需特别贵重的仪器， PCR 产物变性后无需特 殊处理即可直接电泳；实验步骤少，周期短；所用试剂常见，成本较低；适合于进行大样本 筛查，在做DNA测序之前采用此法，可以大大避免盲目测序所带来的麻烦，加快测序速度， PCR-SSCP既能分析DNA的多态性，结合软件分析后，还可以检测DNA序列中的各种突 变，还可以应用到基因制图等领域1. 4. 3随机扩增多态性DNA随机扩增多态性DNA(RAPD)技术最早是1990年，由美国杜邦公司农产品研究中心的 Williams等［5 ］用任意顺序排列的10个碱基的寡核苷酸片断作引物，以未知序列的基因组DNA 作为模板，通过PCR扩增来获得一组随机的不连续的DNA片段。

并将此法命名为RAPD目前RAPD技术已被广泛应用于遗传学的各个方面包括进行品种鉴定和系谱分析，基 因定位，易位系的鉴定和构建遗传图谱等1 . 4. 4 微卫星 DNA 分析微卫星DNA又称简单重复序列(simple sequence repeat， SSR)，广泛分布于生物体整个 基因组中，具有数量多、多态性丰富、保守性强、共显性遗传、进化承受选择压力小，操作 简单、重复性好和检测结果准确等优点［6］微卫星DNA分析法是近十多年来发展起来的一种新兴分子遗传标记微卫星分子标记 是共显性标记， 较其他分子标记方法相比，有更高的个体特异性和可重复性，在生物群体 进化研究、核基因组研究、遗传连锁图谱的构建、亲缘关系鉴定、基因定位、品种鉴定等领 域已得到广泛的应用1. 4. 5 DNA分子杂交技术分子杂交(molecular hybridization )的基本原理是待测的单链核酸序列与已知序列的单 链核酸(探针)间通过碱基配对形成可检出的双螺旋片段这种技术可在DNA与DNA, RNA 与RNA，或DNA与RNA之间进行，形成DNA-DNA，RNA-RNA或RNA-DNA等不同类型的 杂交分子。

作为探针的已知DNA或RNA片段一般为30〜50核苷酸长，探针必须预先标记以 便检出杂交分子标记通常为同位素标记法和生物素标记法分子杂交方法可分为液相杂交和固相杂交法固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固 定在固体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中固相杂交法最为常用常用的固相杂交类 型有：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、组织 原位杂交和夹心杂交等液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，是一种研究最早且操作复合的杂交 类型，应用不如固相杂交那样普遍主要缺点是杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为 困难和误差较高核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性，因而在分子生物学领域中已广泛地使 用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的 诊断等方面1. 4. 6裂解酶片段长度多态性(CFLP)技术裂解酶片段长度多态性(cleavase fragment length polymorphism, CFLP)分析，是近年来 分子生物学领域出现的一种用于研究基因突变和分型的技术，具有快速、灵敏、准确、操作 简便等优点［7］。

CFLP基本原理是：先将DNA加热变性，再冷却到一定温度，使被分开的单链DNA按碱 基配对规律自身形成特定的发夹圈经裂解酶I切断其底部5’端核苷酸链，经电泳后，有 标记的一段会显影，即为CFLP图谱它通过裂解酶E对事先标记的待测DNA作特异性酶切， 产生一组特异性的DNA片段，显影后就形成了一级结构依赖性的结构指纹图谱从而检测 DNA序列的变化二． 分子遗传标记在育种中的应用人类有意识或无意识地对畜禽的表型进行选择以提高其生产性能已有几千年的历史，而 最近几十年才开始进行真正科学、系统的育种至今，在家畜育种中人们仍然普遍采用动物 模型BLUP法进行个体遗传评定，这种方法对于一些遗传力低的性状、限性性状以及一些难 以测量的性状，取得的进展却非常有限同时由于经历了长期的选择，在畜禽性状上的遗传 改良速度也开始呈现变慢的趋势，迫使育种学家寻求一种新的突破性的育种方法DNA分 子标记能够在分子水平上对基因序列的遗传变异进行检测，不受内外环境的影响，检测迅速、 简便，无组织特异性［8］，因此能够广泛应用于遗传育种研究的各个领域人们将占据染色体特定区域的微效多基因群称为一个数量性状基因座(Quantitative trait locus，QTL)。

通过分析影响家畜性状的QTL与分子标记的连锁关系，确定其在染色体上的 位置、单个效应及互作效应，并通过选择可识别的分子标记从而选择具有育种意义的QTL［9］ 分子标记在标记辅助选择中的应用依赖于家畜高精度遗传图谱的构建，与QTL紧密连锁的分 子标记的筛选和QTL的精确定位与标记的连锁分析［10］分子标记能否在育种实践中发挥应 有的作用取决于与目标基因紧密连锁的分子标记，多态性高的分子标记绘制的遗传图谱，分 子标记自动化分析成本的降低、实验的简化和改进应用标记预测育种值的方法这四个因素 ［11］随着生殖生物学和胚胎操作技术的发展，有很多新的技术被用于家畜育种上超数排卵 和胚胎移植(multiple ovulation and embryo transfer， MOET)在育种中的使用，使后裔测定时 在对同胞家系应用个体标记信息进行。