第五章花药和花粉培养.doc

第五章花药和花粉培养一、 概况1. 概念花粉培养：指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉作为外植体培养，形成花粉胚或愈伤组 织，最终发育成花粉植株（单倍体）的技术.花药培养:指应用植物组织培养技术，把花粉发育到一定时期的花药接种到人工培养基上， 以改变花药内花粉的发育途径，形成花粉胚或花粉愈伤组织，随后由胚状体直接发育成植株 或由愈伤组织分化形成植株的培养方式 异同点区别：花药培养属于器官培养范畴，花粉培养属于细胞培养范畴共同点:在培养过程中都是花粉发育，均可获得单倍体细胞系或单倍体植株2. 发展概况1964年印度Gula和Maheshwari成功地从毛叶曼陀罗花药培养获得许多胚状体，并证明胚 状体直接起源于花粉粒，最终从胚状体进一步发育得到单倍体植株日本、法国、丹麦、德国等相继开展花培研究工作，目前己有10个科，24个属、34个种、 250多种高等植物的花药培养获得成功花粉培养始于50年代，Tulecke首先培养银杏的成熟花粉粒得到愈伤组织，随后人们进行了 很多研究，在许多植物上进行花粉培养，同时随着培养技术的逐步完善（看护培养、条件培 养…），获得愈伤组织、胚状体、有的还获得单倍体植株我国花培发展概况始于70年代，将花培与传统育种手段相结合，先后培育出一大批具有研究和应用价值的 品种。

如烟草、小麦、玉米、甜椒等花培新品系、品种1974年，中科院植物所与山东烟草研究所合作，成功育成烟草新品种，并大面积推广，这 是世界上第一个用单倍体方法培养出来的新品种国际公认，我国的花培工作处于国际领先水平c我国有30多种植物进行花培试验，20 多种获得了花粉植株，有一大部分是我国首创，同时在花培方法，机理等方而作了深入研究 德著名学者Melchers:“花药培养起始于印度，而首先却在中国广泛应用，就花药培养的单 倍体育种的应用而言，中国在世界上处于领先地位”3. 意义a. 基础理论研究方面研究减数分裂，花粉生长机制的重要方法用来进行生理、生化、遗传等基础理论的研究花粉粒体积小，数量多，形状、内含物成份基本一致，是比较均一的起始材料，便于在 人工控制条件下研究它们的生长、分化、遗传等变化过程b. 遗传育种二单倍体育种中的意义 可获得纯合二倍体，大大缩短有种周期 具有选择效率高的优点用于远缘杂交育种，克服杂种不育性便于隐性突变体的筛选，大大提高突变育种的工作效率二、 培养方法1. 途径愈伤组织再分化形成植株（脱分化到再分化，变异率提高，混倍现象明显取决于培养基中激素的种类、浓度配比）匚二＞ 花粉植株通过胚状体形成植株 花粉植株（程序简单，不需再分化，一•次成苗）2. 花粉培养优点:不存在体细胞干扰，没有混倍现象缺点:培养技术难度大花粉分离自然散落法：机械挤压法：优点■操作简便■适于双子叶植株，不适于禾谷类，易损伤花粉粒缺点■花粉中易混有体细胞■悬浮液中花粉密度不易控制注意：液体培养基中加蔗糖或甘露醇，调节渗透压，避免花粉吸水胀裂三、影响花培成功的因素有些难培养植物诱导频率很低，有些植物(裸子植物)至今没有获得真正的花培植株花药培养虽然是一项成功的技术，但要获得良好的效果，还需克服许多困难诱导植株成功与否以及诱导频率受多种因素影响(―)供试材料L材料的基因型材料的遗传背景不同，诱导难易程度不同茄科番茄、蔓陀罗、烟草易成功禾本科 水稻优于小麦亚种 水稻粳亚种(40-80%)优于釉米亚种(2%)花药培养力是可以遗传的，且为显性或超显性2. 植株的生理状态和年龄年幼植株花培成功率高开花始期成功率高烟草开花始期时花药比开花后期的更易产生花粉植株烟草开花期第6天，诱导率最高与植株的营养和生长条件有关N饥饿〉高N水稻高温，高N下，诱导率下降，白化苗提高3. 花粉发育时期一一是影响花培成败的最关键因素之一四分体时期单核期…早、中、晚期双核期三核期#不同植物最适诱导期不同曼陀罗、烟草属、水稻一单核早期、双核期均可诱导，以单核中、晚期效果最好小麦、玉米…只有单核中期才能诱导大麦…单核晚期最佳一般采用单核中-晚期的花粉培养不同植物花培的合适花粉发育时期处于单核期的花粉培养最有利于诱导成苗小抱子发育第三期是胚胎形成的临界期，超过了这一时期胚状体就不能形成在小弛子发育过程，花药内激素水平正在不断改变，由于花药的成熟使激素平衡变得不适合, 或为花粉发育所必需的其他一些养分已经耗尽，从而影响了诱导率培养前应确定花粉发育时•期镜检：醋酸-洋红、I-KI染色（禾本科、茄科）、焙花青-烙矶法（木本、番茄）利用相应的形态学指标对于花培没有成功的植物最好选取花粉发育各个时期的花粉进行培养，确定最佳时期4. 材料的预处理一一试验证明，有几种预处理方法能有效提高诱导率低温预处理烟草：7-9C, 7-14 天番茄：6-8 C, 8-12 天水稻：10C, 2-14 天小麦、黑麦：1-3 C, 2-20天常温下N饥饿预处理乙烯、高糖、离心预处理（二） 培养基1. 基本培养基MS应用最多，N6、B5> Nitsch也有应用不同植物种类，适用的培养基不同双子叶：Nitsch、MS十字花科、豆科：B5水稻等禾谷类：N62. 碳源蔗糖应用最广，既是最好的碳源，又起调节渗透压的作用不同植物种类、不同诱导时期最适碳源浓度不同，通常以2-5%为宜烟草：2%诱导胚状体小麦：8-10%愈伤；5・8%分化水稻：4-6%愈伤;2-3%分化玉米：12-15%愈伤3. 激素关键决定于激素种类、浓度、配比实例小麦：2mg/L2.4-D愈伤；< 2mg/L胚状体4. 其它添加物有机附加物、水解乳蛋白、水解酪蛋白、酵母提取物、肌醇、谷氛酰胺等活性炭（0.5-1%）吸附了琼脂中不利于细胞生长的某些杂质吸附了培养基高压灭菌蔗糖产生5-羟甲基糠醛吸附了激素，降低了激素水平（三） 培养方法和培养条件1. 材料的接种保证完全无菌条件、注意接种密度（104-105粒/ml为好），花药组织分泌的活性物质相互作 用有利于诱导密度太高，养分消耗太快；密度太低，诱导率下降。

2. 培养方法液体培养基近年来较多采用优点:诱导率显著提高缺点:有些植物进一步分化困难，白化苗率提高利用条件培养基也可大大提高培养效率3. 培养条件温度：最重要，通常24-28C最适光照：影响分化途径花粉在暗的条件下成为愈伤组织，再光照成为植株在光照条件下成为胚状体（四） 植株的诱导和移栽花粉胚一植株：从花药囊中长出,茎叶细弱，根系不发达，很难直接移栽，需锻炼壮苗愈伤组织---植株：愈伤组织的年龄显著影响分化频率结论：愈伤组织及时转移是诱导分化的关键太早不利于愈伤成活和生长；太晚分化率下降通常，愈伤＞lmm即可转移（五） 花粉植株的倍性和加倍倍性：花粉植株中含有大量的非单倍体非单倍体出现频率与植株种类、花粉发育时期、激素种类和浓度、花粉植株的发生方式、继 代培养时间等有关加倍：大部分单倍体需经人工加倍，通常秋水仙素，0.02-0.4%。