近皮层大鼠C6胶质瘤模型建立探究.doc

近皮层大鼠C6胶质瘤模型建立探究【摘要】目的：建立一种便于开骨窗及肿瘤切除的近 皮层大鼠C6胶质瘤模型方法：立体定向下将C6细胞接 种于大鼠脑皮层、白质交界处，建立近皮层荷瘤鼠模型取 7只模型鼠，分别于接种的第7、11、15天行头颅MRI检查, 了解肿瘤的生长情况行病理HE切片观察、流式细胞DNA 细胞周期分析及GFAP免疫组织化学检测，了解肿瘤的生长 特性和病理特征5只荷瘤鼠及2只正常大鼠经尾静脉注入 5 ALA后，取肿瘤组织及脑组织制成细胞悬液行荧光分光光 度分析，探讨血脑屏障的破坏情况取29只荷瘤大鼠，分 成开骨窗组、开骨窗加取瘤组及对照组，观察生存期结果: 用本法建立近皮层C6胶质瘤模型54只，52只成功建立模型, 成功率96. 3%o病理、流式细胞、免疫组织化学显示大鼠C6 胶质瘤生长特性和病理特征与人脑胶质瘤相似；对照组、开 骨窗组及开骨窗加肿瘤切除组生存期分别为(32. 000 08. 9815)、(41.888 96. 461 8)、(59. 400 0 14. 416 0) do行组间单向方差分析，生存期比较有统计学差异 (P<；0. 05)o结论：该方法建立的胶质瘤模型稳定，生 长特性和病理特征与人脑胶质瘤相似，便于开骨窗及切除肿 瘤，是进行胶质瘤研究的较好模型。

关键词】近皮层C6胶质瘤骨窗大鼠胶质瘤大鼠模型仍是目前研究胶质瘤的较好模型许多 学者将C6胶质瘤细胞接种于大鼠的尾状核区，建立颅内荷 瘤鼠模型目前这一方法已相当成熟[1 3],缺点是接种 的肿瘤位置深在，行手术切除或行热疗、光动力治疗研究时 肿瘤显露比较困难体外细胞实验及皮下荷瘤鼠模型虽然建 模简单，但无法准确模拟颅内特殊的病理生理状况特别是血 脑屏障的影响本实验的目的是建立一种便于开骨窗及肿瘤 切除的大鼠胶质瘤模型，为研究胶质瘤提供一种选择1材料和方法1.1材料C6细胞株：购自中国科学院上海细胞研究所SD大鼠54 只，雄性，质量260 310 g,购自东南大学医学院实验动物 中心5 ALA购自Sigma公司RMPI 1640为GIBCOL公司 产品，胎牛血清购自杭州四季青公司1. 5Tesla MR （东南 大学附属中大医院提供使用），江湾I型C动物立体定向仪 及F 2500荧光分光光度计（南京航空航天大学提供使用）, BD公司产FACScalibur流式细胞仪（南京大学开放实验室）1. 2方法1.2.1细胞培养及动物模型建立C6细胞常规培养于含 10%胎牛血清、青霉素 G （100 1）、链霉素（50ug • ml-1）的RMPI 1640培养基中。

培养条件：100 ml培 养瓶置于37 C. 5%CO2培养箱中，每1 2天换液1次将 处于对数生长期的细胞消化、离心后，用不含血清的RMPI 1640培养基吹打后计数，再次离心洗涤去血清及胰酶后加入 不含血清的RMPI 1640 （含琼脂糖15 mg - ml-1）制成细胞 悬液，调整细胞浓度为1X104^1-1大鼠采用4%戊巴比妥钠（1 ml -kg-1）经腹腔麻醉，立体定向仪固定，常规消毒、铺巾、切开,暴露前卤,用牙科钻于中线右3.5 mm.冠状缝后lmm处钻孔用25 U 1微量注射器将上述细胞悬液 10 nl,距离颅骨表面进针3.5 mm,退针0.5 mm,待细胞沉 淀充分后注射注射速度为1卩1・min-1，注射完毕后留针 5 mino骨孔用骨蜡圭寸闭1.2.2肿瘤鉴定 所建立荷瘤鼠7只，于接种后第7、11、 15天行俯卧横断位、冠状位、矢状位T1WI、T2WI及增强扫 描扫描参数：T1WI采用SE序列；T2WI采用FSE系列；增 强造影剂为轧双胺注射液（Amersham Health公司），剂量 为1. 2 ml • kg-1,经尾静脉注射病理切片：标本经10%甲 醛固定，石蜡切片，HE染色。

免疫组织化学检查：大鼠经颈 总动脉相继以生理盐水及4%多聚甲醛PBS溶液（pH 7. 35） 灌注固定后取脑，制成石蜡切片，脱蜡水化后与GFAP作免 疫组织化学检查，用ABC法染色流式细胞学检查：取第11天荷瘤鼠，处死后取米粒大小的瘤组织，经剪碎、胰酶消化、过滤、漂洗后用70%乙醇固定，行流式细胞DNA细胞周期分 析1.2.3肿瘤对血脑屏障的影响5只荷瘤鼠及2只正常鼠 经尾静脉注入5 ALAo 4h后，荷瘤鼠分别取瘤组织、肿瘤 周边脑组织及对应的左侧脑叶组织，正常大鼠取右侧相应部 位脑组织组织块约3 mm大小，经洗净血液后，剪碎、消 化、过滤打匀制成细胞悬液，行荧光分光光度计分析激发 波长为402 nmo1.2.4颅骨开骨窗，肿瘤切除对荷瘤鼠的影响取29只近皮层胶质瘤模型，其中开骨窗加肿瘤切除组13只，于接 种第11天以接种针道为中心开5 mmX5 mm大小骨窗， 瘤组织并在头带式显微镜下切除；开骨窗组大鼠9只，于接 种第11天同上法开骨窗，但不切除肿瘤；其余7只荷瘤鼠 不予开骨窗，设为对照组3只开骨窗加取瘤组术后行头颅 MRI复查后处死，取脑行病理检查了解肿瘤残余情况其余 所有大鼠观察生存状态和生存期。

1.3统计学处理用SPSS 10.0分析，大鼠生存期记作x-s,行单向方差 分析P<；0. 05为差异有统计学意义2结果2. 1模型建立本实验共接种近皮层C6胶质瘤模型鼠54只所有大鼠 死亡后均取脑，52只接种部位有肿瘤生长，成功率96.3% 2只大鼠脑叶未见有肿瘤生长，但对应在蛛网膜下腔可见有 不规则块状瘤组织，考虑与细胞悬液沿针道流入蛛网膜下腔 有关所有接种成功模型中肝、肺、胰、脾、肾未见肿瘤生 长2. 2 MRI头颅增强扫描示右侧脑叶近皮层高信号占位第7天荷 瘤大鼠占位大小约2 mmX3 mm,厚度约1. 5 mm,肿瘤尚未生 长到脑表面di d荷瘤鼠占位灶可达3 mmX4 mm,厚度约3 mm, 灶周出现水肿，中线轻度左偏，见图lo 15 d荷瘤鼠占位灶 可达4 mmX5 mm,中间厚度可达4 mm,中心可见低信号坏 死灶，灶周水肿、中线偏移明显1只大鼠在接种后出现一 皮下转移灶，经MRI及病理证实为C6胶质细胞瘤，见图1a.为接种第11天荷瘤鼠，见右侧脑叶可见强化的瘤组织, 肿瘤已达脑表面;b.为肿瘤切除术后局部颅骨缺失（箭头），未见明显肿瘤残余;c.存在颅内病灶的同时，右颈部皮下 出现一转移灶（箭头）图1近皮层C6胶质瘤模型大鼠MRI增强扫描图像2.3病理学和免疫组织化学检查肿瘤大体呈鱼肉状，无包膜。

光镜下肿瘤细胞呈梭行， 排列呈一定的极性，核深染瘤组织内见丰富的新生微血管 第7、11天的肿瘤未见成片坏死，但11 d时瘤周边脑组织 中可见小癌巢及散在分布的肿瘤细胞15d以后瘤组织内可 见明显坏死，部分大鼠颅内可见较大转移灶免疫组化在瘤 组织内见散在的GFAP阳性细胞，表明肿瘤为神经源性，见图 2O2.4流式细胞DNA细胞周期分析G0/G1 期占 69. 67%, S 期占 21. 03%,G2/M 期占 9. 30%, 未见明显凋亡峰，表明肿瘤增生活跃，符合肿瘤增值动力学 表现2. 5肿瘤对大鼠血脑屏障的影响取荷瘤大鼠肿瘤组织、肿瘤周边2 mm处脑组织和对侧对 应脑组织制成细胞悬液在荧光分光光度计上分析，在630 nm 处有一明显的波峰以肿瘤组织最明显，但距离肿瘤灶较远 的对侧脑叶脑组织亦可有波峰出现正常大鼠脑组织在630 nm处波峰不明显2.6颅骨开骨窗及切除肿瘤对荷瘤鼠生存期的影响所有22只开骨窗荷瘤鼠，无因手术死亡者术中出血经 脑棉压迫、缝合头皮后即可停止单纯开骨窗组在18 d左 右即可触及骨窗处突起的肿瘤组织，晚期突起有如“寿星 头”样开骨窗加肿瘤切除组亦最终出现上述表现，但时间 较晚。

对照组大鼠14 d后即可出现颅内压增高的表现以 上3组荷瘤鼠终末期都表现为精神萎靡，皮毛不整，进食减 少，体质量减轻，眼睑出血淤斑，偏瘫，部分大鼠出现肢体 抽搐，最终恶液质、死亡对照组生存期为(32. 000 08, 981 5) d,开骨窗组生存期为(41.888 96. 461 8) d,开骨 窗加肿瘤切除组生存期为(59. 400 014. 416 0) do行单 向方差分析，组间均有统计学差异生存期两两组间比较有 统计学差异3只开骨窗取瘤组术后行头颅MRI复查未见明 显肿瘤残余，见图1,但病理显示肿瘤摘除后灶周仍可见较多 量肿瘤细胞浸润和小癌巢，见图2a.肿瘤切除后瘤腔周围‘正常”脑组织内发现薄层肿瘤 细胞，肿瘤向脑组织内呈树枝样浸润(HEX400)； b.为肿 瘤灶周发现的小癌巢(HEX200)； c. GFAP免疫组织化学检查示瘤 组织内可见散在的GFAP呈阳性的肿瘤细胞图2皮下转移灶病理HE染色和GFAP免疫组织化学结果 3讨论脑胶质瘤约占我国原发颅内肿瘤的45%,预后差手术 切除仍是当前治疗胶质瘤的主要方法，术后复发是患者死亡 的主要原因[4]大鼠C6胶质瘤生物学特性与人脑胶质瘤 比较接近，有浸润性生长、新生血管形成的特性，具有GFAP、 S 100蛋白的胶质瘤特异性标志，可较好地模拟人脑胶质瘤 [5 7],具备建立理想胶质瘤动物模型的条件。

瘤细胞易 沿针道扩散是皮层种植的缺点为提高模型的成功率，我们 在接种细胞悬液中加入少量琼脂糖，注射速度控制在1 卩1・min-1,注射完毕后留针5 10 min,骨蜡封闭骨窗等， 确保模型的成功率和一致性试验中为避免蛛网膜下播散， 接种中心并非完全位于皮层，而是位于皮层、白质交界处， 但接种第11天时肿瘤已经到达皮层表面由于采取了以上 措施，我们的颅内荷瘤鼠模型成功率达到了 95%以上接 种第11天的荷瘤鼠，颅内压增高程度尚未明显增加开骨窗 的难度，且肿瘤增生活跃，可能是实验治疗的最佳时机由于我们所建的模型为颅内荷瘤模型，肿瘤对血脑屏障 的影响亦是本实验探讨的一部分目前大都认为5 ALA很 难通过正常的血脑屏障［8 9］o 5 ALA通过血脑屏障被细 胞摄取后，参与一系列代谢过程，产生具有荧光效应的血吓 咻衍生物IX (PPIX),根据其荧光强度即可判定血脑屏障的 破坏程度［10］本实验研究表明肿瘤对血脑屏障的破坏可 能是弥漫性的实验中3只开骨窗取瘤大鼠瘤组织显微镜下完整切除， 术后增强MRI复查未见肿瘤残余但病理结果示瘤腔周围脑 组织中仍有大量肿瘤细胞浸润甚至出现小癌巢，提示临床上 恶性胶质瘤术后很快复发很可能与肿瘤切除术后灶周‘正 常”脑组织内的肿瘤细胞有关。

参考文献】[1] 李维芳，张光养，朱诚，等•立体定向大鼠C6脑胶质 瘤动物模型的建立[J].立体定向和功能神经外科杂志， 2000, 13 (2)： 63 66.[2] BROCKMAN M A, WESTPHAL M, LAMSZUS K, etal.Improved method for the intracerebral engraft of tumour cell and introtumoural treatment using a guide screw system in mice[J]・Acta Neurochir (Wien), 2003,145(9):777 781.[3] 孙远召，杨天明.阿霉素纳米粒对颅内移植G422小鼠的化疗实验研究[J].东南大学学报：医学 版,2006,45(5):341 345.[4] GREENBERG M S. Handbook of neurosurgery[M]. 5thed. New York： Thieme medical publishers, 2001： 550 990.[5]WERB0WETSKIT,BJERKYIGR, 。