种子培养基的配置.pdf

LB培养基配方成分表 (1L 溶液中 )：Tryptone( 胰蛋白胨 ) ：10g, Yeast Extract(酵母提取物 )：5g, NaCl(氯化钠 ) ：10g 若配置固体培养基，则再加入15g Agar( 琼脂) 液态培养基 : 根据《分子克隆实验指南》（J. 萨姆布鲁克 D.W.拉塞尔著） 配制每升培养基, 应该在 950 ml 去离子水中加入 : 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质溶解 . 用 5mol/LNaOH调 pH至 7.0. 用去离子水定容至1L.在 15psi 高压下蒸汽灭菌 20min. LB 培养基是一种培养基的名称, 生化分子实验中一般用该培养基来预培养菌种, 使菌种成倍扩增 , 达到使用要求 . 培养的菌种一般是经过改造的无法在外界环境单独存活和扩增的工程菌. 通过培养工程菌 , 我们可以表达大量的外源蛋白,也可以拿到带有外源基因的质粒, 工程菌的有效扩增是生化分子实验的基础. LB培养基的配方如下 : 胰蛋白胨 (Tryptone) 10g/L 酵母提取物 (Yeast extract) 5g/L 氯化钠 (NaCl) 10g/L 另外根据经验值用 NaOH 调节该培养基的 pH,使其达到 7.4( 该 pH适合目前使用最广的原核表达菌种E.coli的生长 ) LB 培养基的制备一、目的要求1．明确培养基的配制原理。

2．通过对 LB 培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤二、基本原理LB 培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基它含有酵母提取物、蛋白胨 和 NaCl其中酵母提取物为微生物提供碳源和能源，磷酸盐、 蛋白胨主要提供氮源，而NaCl 提供无机盐在配制固体培养基时还要加入一定量 琼脂作凝固剂 琼脂在常用浓度下 96℃时溶化，一般实际应用时在沸 水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用 固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同由于这种培养基多用于培养细菌，因此，要用稀酸或稀碱将其pH 调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖LB 培养基的配方如下：酵母提取物5g蛋白胨 10gNaCl 5g水 1000mLpH 7.4～7.6三、器材酵母提取物，蛋白胨，NaCl，琼脂；1mol/L NaOH， 1mol/L HCl；试管，三角烧瓶， 烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅， pH 试纸（pH 5.5～9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等四、操作步骤1．称量按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物、蛋白胨、NaCl 放入烧杯中。

蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错2．溶化在 上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积3．调 pH在未调 pH 前，先用精密 pH 试纸测量培养基的原始pH 值，如果 pH 偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH 试纸测其 pH值，直至 pH 达 7.6反之，则用 1mol/L HCl 进行调节注意 pH 值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度对于有些要求 pH 值较精确的微生物， 其 pH 的调节可用 酸度计 进行 （使用方法，可参考有关说明书）4．分装按实验要求， 可将配制的培养基分装入 试管内或三角烧瓶内 分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染1)液体分装分装高度以试管高度的1/4 左右为宜2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜3)半固体分装试管一般以试管高度的1/3 为宜，灭菌后垂直待凝。

5．加塞培养基分装完毕后， 在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能6．包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好， 再在棉塞外包一层牛皮纸， 以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好 用记号笔注明培养基名称、 组别、日期三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期7．灭菌将上述培养基以 1.05kg/cm2（15 磅/英寸2），121.3℃，20 分钟高压蒸汽灭菌如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存8．搁置斜面将灭菌的试管培养基冷至50℃左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜9．无菌检查将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养 24～48小时，以检查灭菌是否彻底。