生物技术制药：6 酶工程制药-2.ppt

第五节 酶工程的研究现状一、生物酶工程是以酶学和DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物，主要包括：1、用基因工程技术大量生产酶 2、对酶进行修饰，产生遗传修饰酶3、设计新酶基因，合成自然界不曾有的新酶 1化学酶工程1、天然酶2、化学修饰酶（1）化学修饰酶的功能基2）交联反应3）大分子修饰作用3、固定化酶4、人工模拟酶2二、突变酶1.突变酶概念定点突变( site-directed mutagenesis,SDM)随机突变 (random and extensive mutagenesis,REM)突变酶：主要采用定点突变的技术产生符合人类设计的”突变型”蛋白32.定点突变的方法（1）引物介导的定点突变ACC4Site-directed mutagenesis CAGGTCCAGGCCCAGGCCCAG+ polymerase+ primerreplicationGCCCGGMutantThrtranslationWild typeGTCCAGValtranslationOnly one amino acid changedWild type proteinMutant proteinprimer(1)(2)(3)(5)(4)(6)Val Thr5(2)PCR介导的定点突变ACCCGGGG67（3）盒式突变利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。

83.突变酶的应用（1）提高酶活性及稳定性对活性中心的氨基酸逐个进行突变，找出关键氨基酸进行，得出可信结论9T4溶菌酶和6种设计的变体特性酶 氨基酸的位置 二硫键的数目 相对活性 Tm 3 9 21 54 97 142 164 (%) ()wt Ile Ile Thr Cys Cys Thr Leu 0 100 41.9pwt Ile Ile Thr Thr Ala Thr Leu 0 100 41.9A Cys Ile Thr Thr Cys Thr Leu 1 96 46.7B Ile Cys Thr Thr Ala Thr Cys 1 106 48.3C Ile Ile Cys Thr Ala Cys Leu 1 0 52.9D Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys 2 95 57.6E Ile Cys Cys Thr Ala Cys Cys 2 0 58.9F Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys 3 0 65.9wt：野生型T4溶菌酶；pwt:假野生型酶；AF：六种设计的半胱氨酸变体；10 酵母菌磷酸丙糖异构酶及其变体的热稳定性 氨基酸位点酶 14 78 半衰期（min）野生型 Asn Asn 13变体A Asn Thr 17变体B Asn Ile 16变体C Thr Ile 25变体D Asp Asn 11 酶的稳定性以在100时半衰期或者失活率来表示。

半衰期越长酶越稳定11（2）研究酶的功能基团对靶目标进行突变1.同源序列比较，找出保守区域2.化学修饰3.空间结构信息基础上，进行定点突变12三、酶的分子进化1.定向进化的原理定向进化随机突变选择132.定向进化的策略（1）随机突变易错PCR技术(error-prone PCR)DNA改组(DNA shuflling)：随机引发重组(RPR)：1998年,Arnold提出了一种有效的新方法交错延伸技术(StEP)：是一种简化的DNA shuffling 技术 14易错PCR利用Taq DNA多聚酶不具有35校对功能的性质，构建突变库，定向的选择选出所需性质的优化酶易错PCR（error prone PCR）:在扩增目的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变A. error-prone PCRscreen and select* * * * * * PCR* * * * * * * * library1516连续易错PCR (sequential error prone PCR):即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变A. error-prone PCRscreen and select* * * * * * PCRPCR* * * * * * * * library17（2）同源改组DNA改组(DNA shuffling)又称有性PCR (sexual PCR)181. DNaseI产生随机片段；2. 随机片段变性；3. 随机片段复性；4. 延伸 反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段 19基本步骤 (1)用DNase I消化功能相同的一组基因片段(A)，从而产生随机小片段(B)。

(2)经提纯后，用无引物(经变性后可互为引物)的类似PCR反应重新装配这些小片段成完整长度的重组基因片段(C)，在装记过程中被证明有低水平点突变产生 3)克隆并选择正突变体(D)，并将正突变体的重组基因片段作新一轮的体外重组 20体外随机引发重组(random priming in vitro recombination, RPR) 以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度2122交错延伸(stagger extension process, StEP) 在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步, 缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸此过程反复进行，直到产生完整的基因长度2324（3）非同源改组渐进切割杂合酶技术(incremental truncation for the creation of hybrid enzyme, ITCHY)核酸外切酶对两个亲本进行切割，产生一系列相差单碱基的基因片段，再将两组片段化基因互相连接，产生杂合基因文库25（4）结构域改组外显子改组(exon shuffling）类似于DNA改组，与但与其不同，它是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而DNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段上。

263.定向进化的筛选策略筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关底物显色反应其他的筛选方法, 如加入能产生可见光信号的底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等高通量筛选：固相筛选，ELISA，萤光筛选等定向进化将筛选技术放首位27定向进化的步骤l突变：基因突变库的建立l筛选：基因突变库的活体或离体筛选l基因复制与遗传28目标标酶所需功能方法结结果实实施菌种卡那霉素核苷基转转移酶热稳热稳 定性定位诱变诱变 +选择选择在60-50酶半衰期增加200倍耐热热脂肪芽孢孢杆菌枯草杆菌蛋白酶作用于有机溶剂剂易错错PCR+选择选择在60二甲基亚砜亚砜 活力增强170倍枯草杆菌-内酰酰胺酶作用于新底物DNA改组组+选择选择对对cefotaxime的抗性增加32000倍大肠肠杆菌对对硝基苯酯酯酶有机溶剂剂中的底物特异性和活性易错错PCR+重组组活力增加60-150倍大肠肠杆菌胸苷激酶第五特异性 基因理疗疗交错错延伸+选择选择活力增加43倍大肠肠杆菌-半乳糖苷酶底物特异性DNA改组组+选择选择活力增加66倍底物特异性增加1000倍大肠肠杆菌砷酸脱毒途径砷酸抗性DNA改组组+选择选择抗性增加12倍大肠肠杆菌定向进化的应用29四、抗体酶1.抗体酶（AbzymeAbzyme) )或催化抗体（Catalytic antibody)是一种新型人工酶制剂，是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。

是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物要使抗体成为具有催化功能的抗体酶，只要在抗体的可变区赋予酶的催化特性，就可能成为抗体酶302.抗体酶的制备原则稳定过渡态法31抗体结合部位修饰法用可裂解亲和标记试剂将催化基团引入到抗体结合部位的示意323.抗体酶的制备方法（1）诱导法用设计好的半抗原(过渡态类似物）通过间隔链与载体蛋白（例如牛血清白蛋白等）偶联制成抗原，然后采用标准的单克隆抗体来制备、分离、筛选抗体酶利用过渡态类似物制备抗体酶33（2）基因工程法对单抗中抗体酶结合部位突变进行定点突变341、 抗体酶在帮助戒毒方面的应用用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单酯为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，其催化活性和血液中催化可卡因的丁酰胆碱酯酶差不多，水解后的可卡因片断失去可卡因刺激功能因此，用人工抗体酶的被动免疫也许能阻断可卡因上瘾，达到戒毒目的抗体酶的应用352.抗体酶用于肿瘤治疗抗体介导前药治疗（ADEPT）技术，水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，这样酶就会通过和肿瘤结合的抗体而存在于细胞的表面前药只能被抗体酶水解而不能被内源性酶水解，抗原还要尽量减少免疫原性 。

36五、人工模拟酶 模拟酶:根据酶的作用原理，人为制造的具有酶性质的催化剂利用有机化学合成的方法合成了一些比酶结构简单得多的具有催化功能的蛋白或非蛋白质分子特点：高效，高适应性，结构简单作用机制：稳定过渡态理论,酶先与底物结合,进而选择性稳定某一特定反应的过渡态,降低反应活化能,从而加快反应速度.37环糊精是一种优良的模拟酶环糊精外侧亲水,内侧疏水,形成空穴,可以从水溶液中抽提适当形状的有机小分子,并束缚入空穴通过对环糊精修饰,可使空穴适合不同的底物环糊精催化反应时,先结合再反应.38环糊精模拟的胰凝乳蛋白酶与天然酶催化效率几乎相同胰凝乳蛋白酶活性部位由Ser195, His57, Asp102组成，模拟酶在催化侧链上接上羟基，咪唑基，羧基，发挥催化作用环糊精束缚底物，活性基团发挥催化作用，环糊精的稳定性强于蛋白质成分的天然酶人工合成的冠醚,穴醚,环芳烃也用来构建酶模型39胶束模拟酶胶束在水溶液中提供疏水微环境,可对底物束缚将催化基团如咪唑,巯基,羟基和辅酶共价或非共价连接或吸附在胶束上,可提供“活性部位”单分子胶束酶模型40 分子印迹酶通过分子印迹产生类似酶活性中心的空腔.在结合部位的空腔诱导产生催化基团,并与底物定向排列.分子印迹同天然酶一样,遵循米式动力学41生物印迹酶以天然的生物材料如蛋白质和糖类为骨架，在其上进行分子印迹而产生对印迹分子具有特异性识别空腔的过程。

已成功模拟酯水解酶等以蛋白质为基础制备生物印迹酶过程：1.蛋白变性，扰乱起始构象2.加入印迹分子，使之与部分变性的蛋白结合3.待结合后，用交联剂交联印迹的蛋白质4.透析除去印迹分子42六、酶的化学修饰 酶的化学修饰：提高酶的稳定性,解除酶的抗原性,改变酶学性质,扩大酶的应用范围酶的化学修饰概念 通过主链切割,剪切和侧链的化学修饰对酶蛋白进行分子改造. 温和条件下，可控制的方式使一种酶同某些化学试剂起特异反应，从而使单个氨基酸或功能基团发生共价的化学改变 432.酶的化学修饰方法1.酶的表面化学修饰(1)大分子修饰可溶性大分子，如PEG、右旋糖苷、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层用PEG修饰SOD，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力提高4.1倍44PEG是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。

获认证酶 半衰期相对稳定性 天然SOD 6 min 1 右旋糖酐-SOD 7 h 70 Ficoll(低分子量)SOD 14 h 140 Ficoll(高分子量)SOD 24 h 240 PEG-SOD 35 h 35045(2)小分子修饰酶采用一定的方法（一般为化学法，如氨酸葡萄糖，乙酸酐等）使。