生物化学实验示范报告-蔗糖酶的提取与纯化(正确).docx

生物化学实验示范报告：实验名称：蔗糖酶的分离提取与纯化实验目的：1 •掌握蔗糖酶分离提纯的原理与实验操作方法；2 •掌握有机溶剂分级纯化蔗糖酶的原理和操作方法，了解蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理；3 -掌握酶活、酶比活等基本概念及测定原理、计算和操作方法；4 -巩固并熟练掌握Folin法测定牛血清蛋白和3、5・二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线制作方法，并能通 过回归方程测定还原糖及蛋白质的含量实验原理：蔗糖酶分离提纯原理：酵母中的蔗糖酶含量很丰富，实验以安琪酵母粉为原料，首先采用自溶法破碎细胞壁、 再用乙醇分级和DEAE —纤维素柱层析两步分离提纯，制备纯度较高的蔗糖酶制剂酶分离提 纯的原理与蛋白质的 相同但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活；随时测定酶的比活力，并跟踪酶 的去向、衡量酶提纯的程度及得率有机溶剂分级纯化蔗糖酶原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂一乙醇中溶解度的差异将蔗 糖酶蛋白与 其它蛋白质杂质进行有机溶剂分级沉淀，而使提取的蔗糖酶得以纯化（ 32%的乙醇饱和度沉淀分离杂蛋白，47.5 %的乙醇饱和度沉淀分离酶蛋白）操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应 立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白（复溶），确保酶的活性；pH多选在酶蛋白的等电点附 近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度减少变性，提高分离效果。

蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理： 本实验采用DEAE纤维素（DEAEC11微粒状的、弱碱性的阴离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化它具有分辨率高、化学性质稳定、有开放性的长链结构、有较大的表 面积、对蛋白质的吸附容量大等优点；纤维素上离子基团的数量不多，排列疏散，对蛋白质的吸附不是太牢固，用缓 和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起蛋白质的变性5 糖酶活力与比活的测定：在蔗糖酶的纯化过程中，通过3、5•二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖生成还 原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力在本实验条件下，每 3min释放Img还原糖所需的酶量定义为一个活力单位；通过Folin法测定酶蛋白的含量，计算蔗糖酶的比活单位质量的酶蛋白中所含酶的活力称 为酶的比活主要实验器材：1 .试管、血糖管；2.秒表；3.冰盐浴；4.恒温水浴；5.离心机；6. 721-型分光光度计;7.柱层析装置；8.梯度洗脱装置；9.部分收集器；10.电磁搅拌器；11.冰箱；12. DEAE —纤维素实验操作1 •蔗糖酶的分离提纯（1） •蔗糖酶粗品的制备流程：250mL具塞三角瓶+酵母粉+ 1.5g乙酸钠+ 25mL甲苯于35心恒温水浴中搅30min…补加水60mL ,搅匀，用塑 料薄膜封口，35c保温过夜t自溶液于4000r/min离心20min，取中间水层液再次在4000r/min离心20min，得无细胞 抽提液（初酶曰）t测量初酶液的体积%,并取出5mL待测酶活力和酶蛋白浓度。

实验得到的初酶液体积Vi = 48.5 mL，留5mL测酶活及酶蛋白，其余43.5mL做后续纯化实验2） -乙醇分级和透析流程：将43.5mL初酶液用稀醋酸调节pH值至4.5 t 32%的乙醇饱和度除杂蛋白（计算所需 95%乙醇的量并与初酶液在冰盐浴中预冷，缓慢滴加 95 %乙醇并不断搅拌滴加结束后，于 4000r/ min离心5min，留取上清液）t再用95%乙醇调节酶液到47.5%的乙醇饱和度，沉淀蔗糖酶（此时需准确计算出使粗酶液的乙醇浓度 达47.5%时所需补加95%乙醇的体积；按上述方法加入乙醇后于 4000r / min离心5min） t透析（沉淀立刻用i0mL0.005mol/L, pH6.0的磷酸钠缓冲液溶解后，转入透析袋中，将透析袋放入500mL烧杯中， 加清水透析过夜（中间换一次清水）t次日，将透析液离心得酶液 E2 ,准确测量出酶液E2的体积V 2,并取出5mL待测酶液，测定酶的活力和蛋白浓度实验得到的乙醇分级和透析纯化后的酶液体积为 13.8 mL,考虑到初酶液留下的 5mL，则纯化后的酶液体积校正后应为：V2= 13.8X48.5/ （48.5-5） = 15.39 （mL）。

问题i：乙醇分级纯化的目的是什么？分级纯化后透析的目是什么？2:乙醇分级和透析纯化后的酶液体积为什么需要进行校正？如何较正？（3） - DEAE —纤维素离子交换层析法纯化：（由于实验条件和学时数所限，此步省略）2 .牛血清蛋白和葡萄糖标准曲线定制(1 ) F0li n法定制牛血清白蛋白标准曲线： 按表1进行实验操作，并记录 A650nm处测得的各浓度对应的0D值，一并填入下表中再以蛋白质的浓度为横坐标， 0D值为纵坐标，即可得到标准曲线/IlliJilllit111.11 1 L 1,■ III0 5.00 10.()015. ()0 20.()0 25.()030. ()0 35.表1 Foli n法定制牛血清白蛋白标准曲线实验加样操作及数据记录表 0.50X 6.100.00)-0.10标准牛血清蛋白显色浓度(ug/mL )-实验数据散点平滑连线T牛血清蛋白标准曲线40)93 a试管编号 01 234 567200ug/mL标准牛血清蛋白溶液/mL0.000 30 00.40.500.600.700.800.90.03mol/L pH7.8磷酸缓冲溶液/mL1.00070 00.60.500.400.300.20.1加Folin试剂甲，充分振荡 1mL10min后，加入Folin试剂乙 4mL立即摇匀放入55C水浴中保温5min取出后用自来水冷却1 min，以0号试管为空白对照，在 595nm处比色测定OD值A650nm 0.000 0.155 0.189 0.250 0.305 0.352 0.417 0.459)0表2 Folin法定制牛血清蛋白标准曲线微机数据统计表试管编号0#1#2#3#4#5#6#7#标准牛血清蛋白显色浓度 （ug / mL ）0.0010.0013.3316.6720.0023.3326.6730.00A 650呵实验测试对应浓度的吸光度0.000.1550.1890.2500.3050.3520.4170.459回归方程对应浓度下的吸光度0.000.1500.2010.2530.3050.3560.4080.459线性回归方程斜率（a ）0.0155线性回归方程截距（b）-0.0046线性回归方程丫二= 0.0155X-・ 0.0046实验数据的相关性因素（r ） 0.9990Folin法测定牛血清蛋白标准曲线)0（2 ） 3、5 ・二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线定制： 按表3进行实验操作,并记录A540nm处测得的各浓度对应的0D值，一并填入下表中。

再以葡萄糖的浓度为横坐标，0D值为纵坐标，即可得到标准曲线表中试剂混匀后，在沸水浴中准确反应 15min，取出后立即用冷水冷却，加蒸僧水定容至匀，用Icm的比色杯于540nm处测光密度值表3 3、5 -二硝基水杨酸法定制葡萄糖标准曲线实验加样操作及数据记录表25mL 摇试管编号01 23456789102000ug/mL葡萄糖标准溶液/mL0.000.20 0.400.600.801.001.201.401.601.802.00蒸储水（mL）2.001.80 1.601.401.201.000.800.600.400.200.003.0mL3、5 •二硝基水杨酸（mL）立即摇匀放入沸水浴中准确反应15min取出后用自来水冷却，用蒸储水定容至25ml后，以0号试管为空白对照，在540nm处比色测定OD值Oa54 Onm0.000 0.053 0.108 0.162 0.217 0.274 0.324 0.368 0.4140.4630.503表4 3、5二 硝基水杨酸法定制葡萄糖标准曲线微机数据统计表试管编号01 2345678910标准葡萄糖显色浓度（ug/mL）0163248648096112128144160A540nm实验测试的吸光度0.000.0530.1080.1620.2170.2740.3240.3680.4140.4630.503回归方程对应浓度下的吸光度0.010.0590.1100.1610.2120.2620.3130.3640.4150.4660.517线性回归方程斜率（a ）0.0032线性回归方程截距（b）线性回归方程0.0082Y = 0.0032X + 0.0082实验数据的相关性因素（r ）0.99903,5-二硝基水杨酸法测葡萄糖标准曲线0.600.500.400.300.200.100.000.00f2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00标准葡萄糖显色浓度（ug/mL）18.00+实验数据各散点平滑连线3,5-二硝基水杨酸法测得的葡萄糖标准曲线3 •蔗糖酶活力、蛋白浓度、比活力的测定(1)通过预备实验确定酶活测定以及酶蛋白含量时酶的稀释倍数(2)蔗糖酶活力测定操作：取2支试管，1支加入用pH4.6，0.2mol/L的醋酸缓冲液适当稀释过(稀释倍数均为50)的酶液(Ei、 E2) 2mL，另一支加入2mL 5 %的蔗糖液，把两支试管放入35C水浴中预热恒温。

3分钟后，将2mL蔗 糖加入到酶液 试管中，准确计时，3min后于测定管中加入0.5mL 1 mol /L的NaOH，摇匀，终止酶促反应从酶促反应液准确移取0.5mL溶液放入血糖管中，加入2mL 2%的3,5-二硝基水杨酸试剂摇匀于沸 水浴中准 确反应15min后，加水稀释至定容至25mL，推匀后，于540nm处测光密度问题3:测定蔗糖酶活力时，酶液为什么要进行稀释？如何确定酶液的稀释倍数。