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毕业论文·正文 玻璃体内注射用微球的制备 1 玻璃体内注射用微球的制备 浙江大学药学院 药剂学专业 2001 级同等学力申请学位人员 滕 彦 导 师 梁文权 教授 中 文 摘 要 微球制剂是一种用适宜高分子材料为载体包裹或吸附药物而制成的球形或 类球形的微粒其直径一般在微米数量级,直径小于500nm 者称为纳米粒[ 1 ] 药物制成微球后具有缓释长效和靶向作用等优点 它在体内通过扩散、 材料的 溶解和材料的降解三种方式释放药物 眼部给药是眼科用药的重要途径之一,但由于角膜屏障的存在,泪液的稀释 作用和泪道的引流等原因,许多眼用制剂的生物利用度较差,在治疗应用时受到 了限制,尤其是治疗眼后段疾病为了在玻璃体内获得并维持较高的药物浓度, 必须采用反复玻璃体腔内注射给药这样增加了患者的痛苦,进一步增加了手 术操作的困难和产生并发症的危险另一方面,药物可经鼻腔、口腔等途径吸 收,毒副作用增强因此,近年来许多眼科研究者正在探索眼部新的载药系统, 以求较长时间地维持药物浓度,减少系统性吸收,减少并发症,达到治疗目的。

生 物降解性微球,具有制备较简单,稳定性较好,成本较低等优点， 微球制剂可混悬 在介质中用作滴眼剂或眼内注射剂,减少眼内不适感，微球制剂还可提高药物 的靶向作用因此,微球眼用给药系统逐渐得到更多的肯定 本研究以生物可降解乙交酯和丙交酯的无规共聚物(PLGA)为载体材料,采 用 W/O 型乳化-溶剂挥发方法，以地塞米松为模型药物制备微球；采用正交实 毕业论文·正文 玻璃体内注射用微球的制备 2 验法研究影响微球制备的工艺条件，考察了微球的粒径大小与分布，建立 HPLC 测定微球中地塞米松的方法，测定微球的载药量和包封率，评价载药微 球的体外释放行为 研究结果表明， 影响微球包封率和微球大小的因素次序为： 外水相 PVA 浓度（%，w/v）有机相 PLGA 浓度（%，w/v）投药比[=投药 量/（投药量+PLGA 投药量）],制备地塞米松微球的优化处方为: 外水相为 2%PVA 水溶液, 有机相为 7.5%PLGA 浓度,20%的投药比通过 W/O 型乳化- 溶剂挥发法可以简便、 快速制备得到地塞米松微球， 微球形态完整， 表面光滑， 微球的粒径范围为 4.70μm±1.6μm，载药量为 15.49%±0.31%,包封率为 78.64%±2.23%。

体外释药 10d 累积释放量约 90%对累积释放曲线分别进行 零级（Q=kt）,一级（Q=100-100ekt）,Higuchi(Q=kt1/2),Ritger-Peppas(Q=ktm),扩 散 - 松 弛 (Q=k1t1/2+ k2t),Hixson-Crowell(Q=k1t+k2t2+k3t3) 及 扩 散 - 溶 蚀 (Q=k1t1/2+k2t+ k3t2+k4t3)模型拟合,地塞米松微球释放曲线的拟合方程为 Q=43.9370t1/2+ 0.7817t-036849t2+0.0206t3，R2=0.998,符合扩散-溶蚀释药模型 同样以 PLGA 为载体材料，采用 O/O 型溶剂挥发法制备 5－氟尿嘧啶脱 氧核苷 PLGA 微球（FUR-PLGA-MS） ，光学显微镜下观察微球形态，紫外分 光光度法法测定微球的载药量、 包封率及累积释药量 实验结果为制备的微球 球形圆整，分散性好微球平均粒径为 8.52µm,载药量为 7.66%±0.06%,包封 率为 75.96%±0.80%,体外释放较快，1 小时即释放了 60％从释放结果可以 推测，FUR-PLGA-MS 是混合骨架结构，部分药物可能以分子或细小粒子形式 吸附在微球表面。

为研究地塞米松 PLGA 微球对增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)的治疗效 果，建立了 PVR 动物模型，经兔眼角膜缘后 2-3mm 巩膜处，用 30 号针头将 同源性兔成纤维细胞注入兔眼玻璃体腔中，造成实验性 PVR 动物模型首先 进行了安全性检查，通过分别向兔玻璃体腔内注射 0.1ml 空白微球（10mg） 混悬液和 0.1ml 地塞米松 PLGA 微球（10mg）混悬液，4 周后间接眼底镜观 察 PVR 动物兔眼眼底两组均未见异常在 4 周后静脉注气处死动物，光学显 微镜组织学检查表明两组也均未见异常然后进行药效学实验，将 12 只实验 动物随机分成 4 组， 4 只为空白微球阴性对照组， 4 只为地塞米松阳性对照组， 毕业论文·正文 玻璃体内注射用微球的制备 3 4 只为地塞米松 PLGA 微球组在注射同源性兔成纤维细胞后，立即注入各 组药物混悬液 0.1ml在 1、4、7、14、28d 用裂隙灯显微镜和间接眼底镜观 察 PVR 动物兔眼眼底，(按 Fastenberg 的眼底改变分级方法)实验结果证实， 地塞米松能明显抑制玻璃体视网膜增生程度， 第 28d 时空白微球对照组平均增 生程度为 3.8，视网膜脱离的发生率为 87.5%，地塞米松阳性对照组为 3.0, 视 网膜脱离的发生率为 62.5%，地塞米松微球组为 1.9，视网膜脱离的发生率为 25.0%。

显示微球组延迟了 PVR 的发生，视网膜脱离发生率明显减少，且微球 组和阳性对照组相比有显著性差别(P投药比,结合考虑微球 的形态，粒径的大小及分布均匀状况，得到地塞米松微球的优化处方为: 2%PVA 溶液,7.5%PLGA 有机相浓度,20%的投药比 表 3 正交实验设计 Table 3 Orthogonal experiment design No PVA(%) PLGA（%） 投药比（%） 包封率(%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1 k2 k3 R 0.5 0.5 0.5 4.0 4.0 4.0 2.0 2.0 2.0 59.04 92.63 74.52 33.59 2.5 5.0 7.5 2.5 5.0 7.5 2.5 5.0 7.5 62.52 80.74 85.98 23.46 10 20 35 20 35 10 35 10 20 66.82 81.84 77.42 15.02 21.71 76.20 79.20 87.25 99.90 90.73 78.60 66.13 78.84 毕业论文·正文 玻璃体内注射用微球的制备 19 表 4 正交试验方差分析 Table 4 The analysis of Orthogonal experiment 因素 离差平方和 自由度 均方 F 值 P 值 A B C 误差 E 1695.85 2301.98 459.14 359.14 2 2 2 2 847.925 1150.99 229.57 179.57 4.72 6.41 1.28 0.1 0.9999。

吸光 度与药物浓度有很好的线性关系 3.2.3.3 测定方法回收率: 表 7 为 5-氟尿嘧啶脱氧核苷微球含量测定方法回收率试验结果，表明 5- 氟尿嘧啶脱氧核苷在高、 中、 低三个不同药物浓度时均具有相对稳定的回收率 表 7 测定方法回收率试验结果（n=3） Table 7 The results of recovery tests （n=3） 加入 FUDR 量 （mg） 回收量 （mg） 回收率 （%） 平均回收率 （%） RSD 0.4 0.6 1.0 0.387±0.012 0.589± 0.040 1.031±0.022 96.75 98.17 103.13 99.35 3.35 3.2.3.4 微球的载药量与包封率 由此方法测得 5-FUDR-PLGA-MS 的载药量为 7.66±0.06％，包封率为 75.96±0.80％结果见表 8 表 8 5-氟尿嘧啶脱氧核苷微球载药量和包封率结果 Table8 Drug encapsulation efficacy of FUDR-PLGS-MS 批号 载药量（%） 平均包封率（%）包封率（%） 平均包封率（%） 040319 040402-3 040402-4 7.66 7.61 7.72 7.66±0.06 76.41 76.44 75.04 75.96±0.80 毕业论文·正文 玻璃体内注射用微球的制备 25 3.2.4 5-FUDR-PLGA-MS 的体外释药试验 3.2.4 5-FUDR 在释放介质中的标准曲线 以 pH7.4 PBS 为溶剂，当 C=1～18µg /ml 时，5－FUDR 浓度(C)与其吸光 度（A）之间线性关系良好，标准曲线方程 A＝3.97×10 －2C+9.23×10-3，r＝ 0.9996。

3.2.4.2 微球的体外释药曲线 用累计释药百分数对时间绘图得微球的体外释药曲线（图 9） ，结果表明 1hr 就释药 60﹪，以后释放较慢 0 10 20 30 40 50 60 70 80 01020304050607080 T(h) culmultive release percent 图 9 5－氟尿嘧啶脱氧核苷微球在磷酸缓冲液中的释放曲线 Figure9．Release profiles of FUDR-PLGA-MS in pH 7.4 phosphate buffered saline (n=3) 从释放结果可以推测， 部分药物可能以分子或细小粒子形式吸附在微球表 面，且 FUDR 的水溶性较大，微球表面药物的溶解及扩散则形成释药的突释 效应[12]；从而释放较快 由于亲水性药物在水中溶解度较大，油中溶解度较小，通常认为 O/O 型 乳化挥发法制备亲水性药物微球时药物溶解损失少， 微球载药量高 沈正荣等 [18]采用该法制备的氟尿嘧啶微球，其中粒径 105～180µm 的微球载药量约 60%，释药快，2h 即释放了约 60%O/O 型乳化挥发法同样存在成本高的问 毕业论文·正文 玻璃体内注射用微球的制备 26 题，但以乙腈为内油相，注射用大豆油为外油相，可制得外观圆整光滑，粒径 分布均匀的微球。

成球过程的显微观察发现，因乳滴固化太慢，镜下可见其不 断地融合，在搅拌条件下可能表现为不断的融合和分散，从而导致乳滴中有 FUDR 微晶游离进入外油相，以致体外释放时释放很快虽然对处方和工艺进 行了调整，但均难以显著改变释放快的问题 3.3 地塞米松地塞米松 PLGA 微球动物实验结果与讨论微球动物实验结果与讨论 3.3.1 PVR 动物模型的建立： 3.3.1.1 眼部观察： 在注射同种异体成纤维细胞混悬液后， 检查眼底可见玻璃体有不规则灰白 色细胞团，细胞团位于视盘前动物在注射后结膜、角膜和晶状体透明清亮， 未见明显充血、水肿等，少数动物前房有轻微的房闪，结膜局限性充血，但多 在 2-3d 消退玻璃体内细胞团从第 4d 开始增殖，产生细胞条索随着增殖条 索的增长，视网膜受到牵拉，血管也出现扭曲进一步可见视网膜被拉起，产 生局限性的视网膜脱离和全部视网膜脱离28d 时的具体分级见表 9图 11. 为 PVR 各级的 B 超情况 表 9.实验兔眼分级记录 Tab 9. The record of Fastenberg scores of PVR 实验兔 1 2 3 眼别 右 左 右 左 右 左 分级 Ⅱ级 Ⅲ级 Ⅴ级 Ⅲ级 Ⅱ级 Ⅳ级 Ⅰ级 Ⅱ级 Ⅲ级 毕业论文·正文 玻璃体内注射用微球的制备 27 Ⅳ级 Ⅴ级 图 11.PVR 各级的 B 超 Fig11.The photographs of retinal B scan 3.3.1.2 病理学观察： 兔眼球大。