吉非替尼对结肠癌细胞的生长抑制作用与PTEN表达的关系.doc

1吉非替尼对结肠癌细胞的生长抑制作用 与 PTEN 表达的关系作者：杨黎 潘凤 陈玉英 梁后杰【摘要】 目的 观察表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼对人结肠癌细胞的生长抑制作用，探讨这种作用与结肠癌细胞 PTEN 表达的关系方法 应用体外药物敏感实验检测吉非替尼对 6 种人结肠癌细胞系的生长抑制作用；应用 RT-PCR 检测不同结肠癌细胞中 PTEN mRNA 水平；应用 Western blot 检测结肠癌细胞中 PTEN 蛋白表达水平结果 吉非替尼在体外对 6 种结肠癌细胞系的生长抑制作用差异很大（F=325.51，P0.05）吉非替尼作用浓度为 1 μmol/L 时，Lovo细胞系抑制率达 34%，对吉非替尼最为敏感， 其半量抑制浓度（IC50）10 μmol/L； HT29 和 SW480 为中度敏感（10 μmol/L100 μmol/L各个细胞系中 PTEN mRNA 和 PTEN 蛋白均有表达结论 吉非替尼对结肠癌细胞的生长抑制作用与PTEN mRNA 和 PTEN 蛋白表达水平无明显相关，即 PTEN 表达状态还不能作为预测结肠癌对吉非替尼敏感性的可靠生物学指标 【关键词】 结肠肿瘤； 细胞系； PTEN； 吉非替尼； 生长抑制Relationship between PTEN expressions and inhibitory effects of Gefitinib on the growth of colon cancer cells【Abstract】 Objective To observe the inhibitory effect of Gefitinib, a selective oral epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, on the growth of human colon cancer cells, and investigate the relationship between the sensitivity of colon cancer cells to Gefitinib and PTEN expressions. Methods The inhibitory effects of Gefitinib on 6 kinds of colon cancer cells （Lovo, HCT116, HT29, LS174T, SW480 2and SW620）, the levels of PTEN mRNA in different colon cancer cells, and PTEN protein expressions in colon cancer cells were detected by MTT assay, RT-PCR and Western blot, respectively. Results The inhibitory effects of Gefitinib on the 6 colon cancer cells in vitro varied a lot. When the concentration of Gefitinib was 1 μmol/L, Lovo cells had the most sensitivity to Gefitinib with an IC5010 μmol/L; HT29 and SW480 had moderate sensitivity, and the IC50 ranged from 10 μmol/L to 100 μmol/L; HCT116, LS174T and SW620 were insensitive to Gefitinib, and their IC50100 μmol/L. All the colon cancer cell lines exhibited PTEN mRNA and protein expressions. Conclusions PTEN mRNA and protein expressions might not be associated with the inhibitory effects of Gefitinib on the growth of colon cancer cells. The expression of PTEN can not be taken as the indication of the sensitivity of colon cancer cells to Gefitinib.【Key words】 Colon cancer; Cell line; PTEN; Gefitinib; Growth inhibition吉非替尼（Gefitinib，ZD1839，Iressa）是目前备受关注的靶向治疗药物，是一种具有口服活性的选择性表皮生长因子受体（epidermal growth factor recep-tor，EGFR）酪氨酸激酶抑制剂，能阻断 EGFR 激活的多条信号通路。

吉非替尼对不同的结肠癌细胞系均表现出不同程度的抗肿瘤活性［1-2］PTEN 是一种具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因，当 PTEN 功能减弱或缺失，可引起 EGFR 下游通路中的 Akt过度活化，降低细胞对凋亡的敏感性本文将探讨结肠癌细胞对吉非替尼的敏感性与 PTEN 表达的关系1 材料与方法1.1 细胞系培养人结肠癌细胞系 Lovo、HCT116、HT29 为本室传代保存，LS174T、SW480、SW620 购自中国科学院上海细胞生物学研究所SW620 用Leibovitz L-15 培养液，其余以 DMEM 高糖培养液培养，其中含 10%胎牛血清，各 100 U/ml 的青霉素、链霉素，用 0.25%胰酶消化传代取对数生长期的细胞用于各项实验31.2 药物和主要试剂吉非替尼（阿斯利康制药有限公司）溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，储存浓度为200 mmol/L，-20 ℃保存，仅在每次实验前用新鲜培养液稀释至所需浓度，作用于细胞的 DMSO 浓度不超过 0.1%二甲基四氮唑蓝、DMSO 等购自美国 Sigma 公司；Tripure 为瑞士 Roche 公司产品；M-MLV 逆转录酶为美国 Promega 公司产品；混合 Taq 酶为北京天为时代科技有限公司产品；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；抗 PTEN 抗体购自美国 Cell Signaling Technology 公司；内参 β-肌动蛋白抗体购自美国 Santa Cruz Biotechnology 公司；化学发光试剂盒购自美国 Pierce Biotechnology 公司。

1.3 体外药物敏感实验调整细胞浓度后取 100 μl 以每孔含细胞数 5000 个接种于 96 孔培养板中，37 ℃孵育 24 h 后，每孔加入含不同药物浓度的完全培养液 100 μl，对照组不含药物只加入等量的 DMSO，每组设 4 个复孔，继续孵育 72 h每孔加 20 μl 二甲基四氮唑蓝液（5 g/L），培养 4 h 后小心吸去培养液，每孔加入 200 μlDMSO用 Model 550型酶标仪在 490 nm 下测吸光值（OD 值），计算药物的细胞生长抑制率：抑制率（%）＝（1-实验组平均 OD 值/对照组平均 OD 值）×100%，并求出半量抑制浓度（IC50），每个实验重复 3 次1.4 RT-PCR 检测按 Tripure 试剂说明提取细胞总 RNA，取 2 μg RNA 合成 cDNA根据 Gene Bank提供的 PTEN mRNA 序列设计合成引物上游引物：5′-4GGTTCACATCCTACCCCTTTG-3′，下游引物：5′-CATTCTTTGTTGA-TAGCCTCCA-3′，产物长度 453 bpPCR 反应条件：94 ℃预变性 2 min； 94 ℃ 30 s， 56 ℃ 30 s， 72 ℃ 90 s，35 个循环；72 ℃延伸 10 min。

PCR 产物用 1.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定以磷酸甘油醛脱氢酶为内参照，产物长度 715 bp1.5 Western blot 检测以 RIPA 细胞裂解液提取各种细胞总蛋白以 Bradford 法测定蛋白浓度取各组50 μg 蛋白上样，经 10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（10% SDS-PAGE）电泳分离，电转移至 PVDF 膜抗 PTEN 一抗（1∶1000）4 ℃孵育过夜HRP 标记的二抗（1∶2000）室温孵育 1 h，避光显影检测杂交信号1.6 统计学分析数据用 x±s 表示，应用 SPSS 13.0 软件进行单因素方差分析P0.05 为差异有统计学意义2 结果2.1 结肠癌细胞系对吉非替尼的敏感性吉非替尼在体外对 6 种结肠癌细胞系的生长抑制作用差异很大（图 1）在吉非替尼作用浓度为 1μmol/L 时，Lovo 结肠癌细胞系的抑制率已达 34%，2.2 结肠癌细胞系 PTEN mRNA 表达RT-PCR 结果显示， Lovo、 HCT116、 HT29、LS174T、SW480 和 SW620 结肠癌细胞系均不同程度表达 PTEN mRNA（图 3）其灰度值依次为51.31±0.04，0.96±0.06，0.97±0.11，2.38±0.07，1.36±0.05，0.95±0.08，其中 LS174T表达最强，其他细胞系间无差异。

2.3 结肠癌细胞系 PTEN 蛋白表达Western blot 检测结果可见， Lovo、 HCT116、HT29、LS174T、SW480 和 SW620结肠癌细胞系的 PTEN 蛋白均有表达，但表达相差不大，见图 4其灰度值依次为1.05±0.11，0.59±0.03，1.12±0.15，0.90±0.13，1.10±0.16，0.53±0.14 2.4 各结肠癌细胞系对吉非替尼的敏感性与相应 PTEN 表达水平的关系Lovo 细胞系对吉非替尼最为敏感， LS174T、HCT116 和 SW620 的敏感性最差，耐药倍数是 Lovo 的 20～30 倍，而 PTEN 表达在 Lovo 与耐药细胞之间的差异性却不明显另外 HT29 和 SW480 属中度敏感，但其 PTEN 表达与对吉非替尼最不敏感和最敏感的结肠癌细胞之间相差也不明显3 讨论目前，吉非替尼对结肠癌细胞生长抑制作用的研究多集中于 EGFR 和磷酸化EGFR 表达以及 EGFR 酪氨酸激酶域突变［3］然而越来越多的研究发现 EGFR突变在结肠癌中并非一个常发事件，并且 EGFR 活性也不能完全决定肿瘤细胞对吉非替尼的敏感性［4］。

EGFR 的下游信号通路并不为药物所阻断，可能是细胞内的信号发生变异，不依赖 EGFR 转导的信号而促进肿瘤细胞增殖［5］PI3K/Akt通路是 EGFR 下游信号通路的关键组成部分，在肿瘤细胞对吉非替尼产生耐药时PI3K/Akt 通路活性也有所改变当 PTEN 功能减弱或缺失，在细胞膜上磷脂酰肌醇三磷酸盐积聚，将引起 Akt 的异常活化PTEN 在多数恶性肿瘤中表达降低或缺失，在肿瘤发生、发展和转移中发挥重要作用，而且在 PI3K/Akt 通路中最易发6生活性改变［6］本研究入组结肠癌细胞系以 RT-PCR 和 Western blot 检测 PTEN mRNA 和PTEN 蛋白均有不同程度表达，其中 mRNA 水平以 LS174T 表达最强，而在蛋白水平 LS174T 和其他细胞系差异不明显这可能与转录后的蛋白翻译和修饰有关研究结果与国外文献报道相符［7］PTEN 表达缺失在结肠癌可能并不常见，也许PTEN 多表现为表达减弱或功能失活本研究观察了 6 种人结肠癌细胞系对吉。