2021年用ImagePro-Plus-分析免疫组化图片PPT课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式.1用Image-Pro Plus ( IPP ) 分析免疫组化图片 1.免疫组化图片分析原理n依据染色染料颜色的深浅及分布面积大小来确定目标蛋白的量；n染色区域分布面积与目标蛋白量成正比；n染色的颜色深浅与目标蛋白量的定量关系符合朗伯-比尔定律，是对数关系；2.1.1光密度与灰度困惑人的不同概念n光密度：吸取光的物质的光学密度；（optical density,就是常说的OD值）光密度值是直接与染色物质的量相关的；n灰度：灰是不够黑，是反射亮度的单位；电子照片上像素的亮度称为灰度；3.单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式.4Gray: between white and blacknExample: n1.The bright value on display screen is gray value.n 2.The dark value on a white paper is also the gray value.255Optical Density:吸光物质的光学密度.n被测物质的量越多，光密度(OD值)越高，透射出的光越少，反映在照片上就越黑；nOD值与物质的量直接相关，数字图象上点的灰度值与对应物质OD值成对数关系，符合朗伯-比尔定律；n理论上OD值是从零到无穷大；实际应用中，OD值的范畴常用0-2.0或者0-3.0；5.用OD值是正确的n分光光度计与酶标仪的测定值是OD值n透射的显微镜图象上的光强度要用OD值n蛋白电泳条带的测量也是OD值；n萤光显微镜及萤光分光光度计的测量值是萤光强度(Fluorescence intensity)n用EB染色的DNA凝胶电泳条带也是萤光强度，但处理方法与光密度相同，故也用OD值；这个OD与前面的OD又有不同的意义；它就是荧光的光密度；反映着荧光物质的多少；6.处理照片时用的却是灰度n各种图象被拍照成照片进行数字图象处理时，运算机是对比片的灰度进行测量和运算的；为了定量物质含量，最终仍是需要转换为OD值来表示；n所以对免疫组化照片的分析结果应当是一个OD值，光密度；不应当是灰度；n精确地说，是对免疫组化照片的特定染色区域的灰度进行分析从而测量出组织切片的光密度值；7.用标准样品才能把OD值与样品量关联到一起nOD值是一个没有单位的相对值；n使用酶标仪或分光光度计时要作标准曲线；对电泳条带进行定量分析时一样要作标准曲线；n电泳条带照片的灰度值与样品量的关系为指数函数；在把灰度值转换成OD值时，用一个标准点进行定量分析是不精确的；多个标准点的标准曲线亦有很大误差，因此只能说是半定量分析；8.1.2定量分析的指标：IOD ( Integrated option density )与Mean Densityn将图片上各点的光密度值累加起来，得到IOD；此值与目标物质的总量成正比；nIOD值除以有效目标分布区域的面积，得到Mean density，此值反映了目标物质的单位面积浓度；对样品照片进行数字图像分析比较时，就是比较它们之间的平均光密度值的大小；9.1.3比较两张照片的染色物质量的差别n两张照片染色深度一样，染色面积大的质量大照片A照片B10.比较两张照片的染色物质量的差别n两张照片染色区域面积相同，染色深的质量大照片A照片B11.这回该怎么看？nA的颜色深，面积小；nB的颜色浅，面积大；照片A照片B12.比较体积！尺寸光密度13.1.4 实际图片的情形很复杂的；n阳性样品染色深，阴性样品染色浅；14.直接比较整张图片的IOD等于在比较整张图片的mean density15.哪一个染色物更多？n染色区域颜色深度接近，染色面积有差异；16.使用不同的area会得到不同的结论要结合切片情形来判定；nIOD对整张图片的面积作平均；nIOD对特定组织区域的面积作平均；nIOD对显色的组织区域作平均；17.对整张图片区域进行平均的情形比较少，这张图片中黄色的IOD值主要来自于中间一块区域内；18.右上角的空白区面积应当扣除；19.或许应是这个特定的组织区域20.这个区域是特定染色的区域；在运算IOD时能同时运算出来，但以此为平均面积往往并不正确；21.对单个细胞的分析比较n单个细胞的IODn单个细胞的mean densityn照片上各细胞IOD或mean density的平均值22.边界不清晰的贴壁细胞n整张图片IOD/细胞个数（照片中细胞数目不多，数起来不费事）23.细胞簇的分析n测量整张图片黄色区域IOD；n再测量细胞分布的区域面积 area；n对染成蓝色的细胞核计数，作为细胞数N；n以 IOD /（N ）作为统计指标；或IOD/area24.2.从图片上分析光密度方法 的技术进步n简洁测量整张照片的光密度值；n在照片上随机选取数个区域，测量其光密度值；运算其平均值作为整张照片的光密度值；n在照片上精确选择被染上染料的特定颜色的区域，运算这些区域的累积光密度值（IOD），进而运算统计区域的平均光密度值；25.2.1测定整张照片的光密度-图象分析仪n其测定原理有点象分光光度计，直接测定切片的整体光密度；n可以依据照片上象素点的亮度来区分测定区域n其缺陷是显而易见的；复染上的其他颜色的染料也会产生光密度吸取，导致严峻的干扰；26.2.2 抽样测量光密度n在彩色电子图片上选取目标颜色区域，抽样测量这些小区域的灰度值，取其平均值作为比较染色深浅的指标；随机选取几个区域但是能作到“随机”吗？27.2.3 ImagePro plus的特殊优势；n精确地依据一个颜色标准来选取一个AOI (area of interesting ) ；测量这个区域的光密度参数；28.使用IPP比前两种方法更好；n在查到文献中使用的图象分析方法是前两种的时候，完全可以用IPP的分析测量来代替；结果更加精确；不必照搬文献上所述的方法；随着运算机技术的进展，以后或许仍会有更好的图象分析方法及图象分析程序的；29.3.用IPP分析免疫组化图片的过程n拍照样品照片；n选取图片上具有染料色调的区域（AOI，area of interesting）；n测量该区域的IOD；n选择并测量有效统计区域的面积n运算光密度平均值IOD/area（ mean density ）n运算同一试验组切片各照片的平均及标准差；n用统计学方法分析各试验组的平均mean density之间是否有显著性差异；30.3.1用于免疫组化半定量分析的照片拍照n与一般显微镜照片不同，用于免疫组化分析的显微镜照片有其特殊的拍照要求；31.显微镜光源n正确调整显微镜光源为日光色温的白色光；此时是加蓝色滤光片，灯丝电压为9V左右；一般的显微镜上都会有指示的；此时的镜下视野会感觉光明得有点刺眼；n不能通过调整聚光镜光圈的方法减低亮度，这会影响到光学系统辨论率及图象的清晰度；n不能加过大的灰度镜减低亮度；用25%的ND滤光片仍行；6%的ND滤光片常导致颜色失真；n假如照明光源不白，有偏色，将直接影响到照片颜色，从而使得测量结果不精确；32.固定显微镜的工作条件n不仅是光源亮度，除了更换样品时调剂载物台位置，其他部件一律固定下来；特殊是不要来回切换使用不同放大倍数的物镜；使用一个物镜拍照全部的照片后，再切换到另一个物镜上拍照照片；n为保证显微镜光源的稳固一样，全部照片应当一次拍照完成；不能分数次拍照；如能给显微镜加上稳压电源就更好了；这能保证显微镜光源亮度的稳固；33.必需使用手动掌握曝光的相机n对每张照片要使用相同曝光时间，而不是由相机自动掌握曝光；n染色深的阳性样品就应当拍照得较暗；染色浅的阴性对比样品就应当拍照得较光明；n各种拍照条件确定后，就必需使用这个条件一次拍照完全部的照片；以保证它们的曝光一样；34.掌握相机曝光时间n要把相机曝光时间掌握到使视野中空白的地方出现纯亮的白色；n拍照出的照片上，没有组织的空白处的背景灰度值应达到230左右；可以使用图象分析软件测量一下空白处的背景灰度值；低于230的背景灰度值很简洁产生颜色的偏离，会影响到图像分析数值的偏差；同时背景灰度值也不宜过高；n把空白灰度值调到230以上相当于在分光光度计上调剂100%透射；35.背景的影响n左图：暗且偏蓝的背景严峻影响到了阳性区域的色调；而且降低了黄色象素点的IOD值；这会严峻影响分析结果；有的CCD具有手动较正色温的功能，可以较正一下背景色调，但暗背景既使不偏色也是影响分析结果的；36.较暗的背景值对分析结果的影响显著性差异无显著性差异37.扣背景后照旧没有显著性差异留意误差线增大了，照旧没有显著性差异38.不能使用相机的自动白平稳n自动白平稳功能是相机依据照片总体颜色情形自动对每张照片进行白平稳校正；这会严峻影响分析测量的精确性；显微镜照片用一两种染料染色，照片的颜色就应当是不平稳的，不能校正；39.最好使用专业CCD拍照n民用数码相机适用于拍照日常生活中的照片，其自动曝光，自动白平稳功能会有效改善照片的直观成效；但对于显微镜照片，这些功能却会转变照片的原始面貌，而且它对每一张照片都使用了不同的拍照条件；严峻影响照片的分析测量结果；要想关闭这些功能，往往要进行很复杂的设置；n不能使用自动白平稳校正，但在拍照前使用手动的白平稳校正背景颜色却是必需的；在拍照照片时要对相机进行背景颜色校正，使得拍照出的照片中空白的背景呈白色；这种较正将应用于全部拍照的照片上，与自动白平稳较正不同；自动白平稳较正是对每一张照片都进行各自不同的颜色较正；40.应当把照片存为无损压缩格式TIFFn特殊是对于染色较浅的图片，储存为jpeg格式后会缺失亮度细节，导致测量误差增大；留意那些马赛克41.总结拍照留意事项：n调整显微镜光源亮度（电压9伏），足够白，足够亮；n调整相机曝光时间，使背景出现白色；灰度值最好能达到230以上；n确认相机未使用自动白平稳功能；但要使用手动校正白平稳功能校正背景颜色为纯白色；n使用同样的显微镜工作条件与相机工作条件（曝光及白平稳设置）一次拍照完全部照片；n储存照片为TIFF格式；相素不必太大；42.3.2用Image-pro plus分析免疫组化图片n与photoshop不同，image-pro plus是一个图片分析和定量测量软件；nIPP的功能不是用来美化图片，假如照片成效不好或分析结果不抱负，要从切片处理与拍照过程上找缘由，而不应试图通过对图片的修饰与处理来解决问题；通过IPP的分析测量只应当精确地反映图片本身的真实测量数据；43.3.2.1开头使用IPPnIPP的程序界面是典型的windows风格；它包含了最常用的一些windows程序的一些通用工具；n进入IPP后的第一件事就是打开一幅待分析的图片；44.45.将分析图片信息储存到数据库中n在程序中储存分析图片过程信息是储存试验原始数据的基本原就，必需遵守；n将图片信息及图片分析过程及分析的信息存入IPP程序数据库是一种储存试验原始数据的操作；要留意对同一张图片进行同样的操作，由于一些手动的操作无法精确地重复，所以会显现两次同样的测量得到有差异的结果的情形；这也是储存测量结果的理由之一；46.3.2.2进行光密度值较正；47.光密度值校正n前面曾经说过，电子照片上象素点的强度是以灰度值来定义的，对8bit的数字图象，最亮的白色其灰度值为255；最暗的黑色其灰度值为0；这正好与免疫组化染色的光密度值（OD）相反，所以必需进行校正；定义灰度值大的白色为光密度值=0；定义灰度值最小的黑色光密度值为无穷大；为便利运算，常常把纯黑点的光密度值定为2.0或3.0；n光密度值与灰度值的转换关系符合朗伯-比尔定律，因此是对数关系；n光密度较正的另一个作用是扣除背景；照片的白色背景处的灰度值（光密度值）往往小于255，定义这个小于255的值为光密度零点实际上就是在扣背景；48.正规的光密度值较正n理论上，应当制作已知量的标准样品（空白样，标准样系列，全黑样品）来进行光密度值较正；能得到更精确的分析结果；n在实际操作中，标准样的制作特别麻烦，而且难于精确制作；有用性并不大。