UPLC-MSMS测定小麦粉中五种真菌毒素.doc

UPLC-MSMS测定小麦粉中五种真菌毒素罗晓燕林玉娜曾涛刘莉治胡国媛广州市疾病预防控制中心广东广州510440目的采用超高压液相色谱-串联质谱联用技术UPLC-MS/M S,同时测定小麦粉中5种真菌毒素方法样品用84/16的乙腈/水混合液匀浆 提取超声提取30 m in，离心后，上清液经MycoSep226多功能净化柱净化，经 AcquityUPLC BEH C18 柱(50 mm × 2.1 mm, 1.7 μm particle size)分离，6 min内5种真菌毒素完全分离结果采用外标法定量，在2μg/L〜 100μg/L的浓度范围内呈良好的线性关系，r>0.996o加标平均回收率为: 82%〜110，RSD： 1.7%〜9.6%;检出限<2.0μg/kg结论该方法具有预处 理简单、检测速度快、灵敏度高的优点，可适用于小麦粉样品中真菌毒素的确认 和准确定量检测，可满足我国对真菌毒素的最低检出要求运用建立的方法对广 东省各地的396份小麦粉进行含量测定关键词】外标法；UPLC-MS/MS;小麦粉；真菌毒素R657.63A1276-7808 ( 2015)-07-369-02大多数的谷物非常容易遭受真菌的污染，严重影响着食品安全［1］。

单 端孢霉稀族 B 矣毒素［Deoxynivalenol(DON)、3- AcetyldeoxynivalenoK 3- ADON)、 15 - Ace tyldeoxynivalenol ( 15 - ADON)、Nivalenol (NIV)、Zearalenone (ZON)］，是最为普遍存在的污染真菌如果食用含上述毒素的谷物食品，则会产生极大的 毒副作用单端孢霉烯族B类毒素能够导致厌食、呕吐、贫血、出血以及免疫 抑制的症状［2］因此，欧盟对脱氧雪腐镰刀菌焼醇(Deoxynivalenol： DON)、玉 米赤霉焼酮(Zearalenone, ZON)等分别做出了 500〜1000μg/kg，20〜 75μg/kg的限量规定；食品安全国家标准GB 2761—2011食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量中规定谷物及其制兄(大麦、小麦、麦片、小麦粉)中DON限量指标是1000μg/kg，谷物及其制品（小麦、小麦粉）中ZON限量指标是 60μg/kgo目前检测真菌毒素的检测方法主要有薄层色谱法、气相色谱法、酶联免 疫法、高效液相色谱法和液相色谱一质谱联用法；检测ZON的国标为GB/T 21982 —2008,液相色谱一质谱联用法，检出限为lμg/kg,国标GB/T5009.209— —2008为高效液相色谱法，检出限为5μg/kg;检测DON的国标为GB/T 23503 —2009,高效液相色谱法，检出限为100μg/kg。

S前没脊能同吋检测上述5 种真菌毒素的国标方法，为完成本次小麦粉中真菌毒素污染情况调查，进行超高 压液相色谱一串联质谱联用法同时测定小麦粉中5种真菌毒素的方法研究1材料和方法1.1主要试剂和仪器雪腐镰刀菌烯醇Nivaleno （INIV）纯度：99%，玉 米赤焼酮Zearalenone （ ZON ）纯度：99%，脱氧雪腐镰刀菌焼醇Deoxynivalenol （DON ）纯度：99%，3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇3-Acetyldeoxynivalenol （ 3- ADON）纯度：99%，15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇15-Acetyldeoxynivalenol（ 15 -ADON）纯度：99%购自德国 FLUKA 公司MycoSep226 AflaZon+Multifunctional 多功能浄化柱（美国RomerLabs公司）甲醇（质谱纯）、乙腈（质谱纯）、醋酸 铵（质谱纯）、氨水（质谱纯）、超纯水1.2仪器色谱仪器：Waters Acquity Ultra Performance LC system （美国 Waters 公 司）；质谱仪器：Xevo TQ MS （美国Waters公司）1.2.1 色谱条件：AcquityUPLC BEH C18 柱（50 mm × 2.1 mm, 1.7 μm particle size美国Waters公司）；流动相A: 0.2%的氨水，流动相B:乙腈。

梯度洗脱：0〜6 min流动相A 97%〜2%，6〜7min保持流动相A比例2%，7〜 7.8流动相A2%〜97%，7.8〜10min保持流动相A比例97%进样量为10μL 流速为 0.35 ml/min1.2.2质谱条件：Xevo TQ MS （美国Waters公司）；仪器采用负离子接口 模式，毛细管电压：2.5 kV；锥孔电压：40 V；离子源温度：150C;锥孔反吹气流量：50L/h；脱溶剂气温度：350C；脱溶剂气流量：550 L/h；碰撞池压力： 3.0 ×10-3 mbar数据采集0〜6min，6〜lOmin自动切换至废液采用多 反应监测（MRM）模式采集质谱数据，MRM质谱参数见表11.3样品来源分别从广东省22个县市的超市农贸市场随机获取396份 小麦粉样品，室温下保存1.4标准溶液的配制分别称取5种真菌毒素标准品适量，84/16的乙腈 /水溶液溶解，分别配制成100μg/mL的储备液，通过84/16的乙腈/水溶液 梯度稀释，制备成为一系列标准溶液，浓度为5.0μg/L、10.0μg/L> 20.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L、200.0μg/L、500.0μg/L，各 取15.00mL分别添加进空白的小麦粉样品（即不含被测组份的样品）中，每份空 白的小麦粉样品准确称量为5.00 g,超声波超声30min，5000r/min下离心15 min。

吸取上层清液5 mL过MycosepTM226多功能浄化柱，净化后液体用0.22 μm 微孔滤膜过滤，进样10μL,制成标准曲线1.5样品前处理准确称取小麦 粉样品5.00 g于40mL的离心管中，加入15 mL乙腈/水（84+16）溶液超 声波超声30min, 5000 rpm下离心15 min吸取上层清液5 mL过MycosepTM226 多功能浄化柱，浄化后液体用0.22 μm微孔滤膜过滤，进样10μL2结果与分析2.1样品预处理方法优化本试验希望寻找一种方便快速的前处理方法， 在保证冋收率及检测灵敏度的前提下尽量简化前处理步骤，MycosepTM226多功 能浄化柱是用于真菌毒素样品检测的高效率前处理工具，米用MycosepTM226 多功能浄化柱，通过试验考察15mL、20mL、25mL提取液体积对冋收率的影响， 确定乙腈/水（84/16）提取液的最佳提取体积为20mL2.2色谱条件的优化要实现5种真菌毒素尽可能分离，必须选择合适的 流动相，实验中弱洗脱溶剂中分别加入5mmol/L醋酸胺、0.2%氨水、5mmol/L 甲酸胺、5mmol/L二乙胺（用醋酸将pH调至8）等缓冲盐进行试验，结果表明 加入0.2%氨水后，灵敏度最高。

冇机相选择乙腈2.3质谱条件的优化为提高检测的灵敏度，通过对毛细管电压、锥孔电 压、离子源温度、锥孔反吹气流量、脱溶剂气温度、脱溶剂气流量、碰撞池压力 以及质量分析器参数进行优化，并对5种真菌毒素的碰撞能量进行优化，以提高 各检测组分的检测灵敏度优化后的参数见(1.1),在该条件下，以各B标化合 物的定量离子、定性离子为选择离子，则质量浓度为2.0 μg八的真菌毒素混 标的选择离子色谱图，见图13.总结本研究建立了一种高灵敏度、高选择性、合理、可靠、快速的同吋测定 小麦粉中真菌毒素的UPLC串联质谱的新方法通过多功能浄化柱浄化，同时选 择合适的流动相及流动相梯度，并利用串联质谱仪本身的自动切换功能，较好的 消除基质干扰，达到精确定量的0的在广东省22个县市的超市农贸市场随机 抽取396份小麦粉样品进行检测，发现60%以上样品受到真菌毒素污染，因此奋 必要对谷物中真菌毒素进行含量测定，以控制谷物样品中真菌毒素的污染[1] Kuiper- Goodman，• Mycotoxins risk assessment and legislation[J].ToxicolLett, 1995, 82 (6)： 853- 859.[2] D Mello, JPF, Placinta, et al. Fusarium m ycotox ins： a review ofglobalim plications for animal health welfare and productivity [J].Ani.alFeed Sci Technol1999，80 (2)： 183 – 205.[3] Cohen H , Lapoin teM.Capillary gas- liquchromatographicdetermination of vomitoxin in cereal grains [J】J A ssociat ion 0fficialAnalyChem, 1982, 65 (4)： 1429 – 1434.[4] Mateo JJ, Mateo R，Hinojo, et al. Liquid chrom atographicdetermination of toxigenic secondary metabolites produced by Fusariumstrains[ J]. J Chromatogr A， 2002, 995 (2)： 245 – 256.[5] Michael S，Franz B，RudolfK, et al.Development and validation ofa liquidchromatography - tandem mass spectrometric method for thedetermination of 39mycotoxins in wheat and maize[ J].Rap idCommunications in Mass Spectrometry, 2006，20 (11)： 2649-2659[6] Yiping R， Yu Z， Shuangl iang S， et al. Simultaneousdeterminationof multi- component mycotoxin contaminan ts in foodsand feeds by ultraperformance liquidchromatography tandem massspectrom etry[J].JChrom atogr A,2007, 1143 (1)： 48- 64.[7] Karolina G，Agn ieszkaW，P iotr G, et al.Occurrence of estrogenicmycotoxin - Zearalenone in aqueous environmental samples withvariousNOM content[ J]Wheat R es，2009，(10)： 1016-1018[8]Memg J.Zhang J , Zhang M， et al.Chinese Journal ofChromatograpy，2010，28 (6)： 601-614罗晓燕（1964—），女，研宄生，主任技师，主要从事理化检验工。