分析方法验证中检出限和定量限的测定.pdf

1 KS Lam _________________________________________________________________________ 分析方法验证中检分析方法验证中检出出限和定量限的测定限和定量限的测定 新的 USP 章节“方法验证用统计学工具”，已在 2016 年 9 月药典论坛（PF）42（5）中公开征求 意见 章节是作为通则“药典方法的验证”相伴的章节提出来的，其目的是提供统计学方 法，用于分析方法的验证 检出限 (LOD) 和定量限 LOQ)适用于杂质测定中的杂质限度检查项目的方法验证 按照国际协调会议(ICH)指南 Q2B, 检出限和定量限的测定方法有三种, 一是目测法; 二是信噪比法; 三是 响应值的标准偏差和校准曲线斜率如下 检出限 = 3.3σ/S (1) 定量限 = 10σ/S (2) (σ: 标准偏差；S:斜率) 回归线的残余标准偏差或回归线的 y轴截距标准偏差都可以作为标准偏差 ICH 方法的计算相对简单但作为统计程序，不能令人满意因此 USP 修改 ICH 检出限和定量限的计 算公式其两个原因如下： 首先，由于 σ 通常是未知的，因此必须确定如何最佳地估计该参数。

这是复杂的，因为 σ 会随分析物 浓度的变化而变化Horwitz 在 1980 年提出了喇叭形的误差曲线图，如图所示 两个常用估计是（1）空白响应的标准偏差和（2）从关于浓度信号回归线的偏差获得的标准偏差这个 值的选择需要是在 LOD 附近最能代表 σ 的实验室通常会选择 σ 的最差值 2 在对杂质进行测定时，将面临两个问题：一是避免错误 α，即杂质不存在时误将其检出；二是避免错误 β，即确实存在有害杂质时而将其漏检因此应该避免低估检出限值而导致夸大 II 型错误率（β）和缩小 I 型错误率 (α) 第二个统计关注点是如何纳入不确定性，由于浓度信号回归线的准确斜率是未知的因为回归线是一个 估计，因此检出限在分析信号空间本身就是一个估计考虑到估计回归线中的不确定性与未来相关联的 变异性, USP使用如下预测区间计算公式来纠正这两个缺点 预测区间计算预测区间计算公式公式 (3) (4) S = 回归线标准误差 = 平均浓度平方 m = 斜率 n = 回归分析的观测数 = 回归线的浓度 LOD 和和 LOQ 计算计算 例子 浓度浓度 X (mg/mL) 面积面积 (信号信号) 0.01 0.00331 0.02 0.00602 0.05 0.01547 0.10 0.03078 0.15 0.04576 0.25 0.07592 3 统计统计 值值 n 6 m 0.3032 S 0.0002 t1−α:n−2 = t0.95:4 2.132 t1−β:n−2 = t0.95:4 2.132 0.0967 0.0419 I. USP 方法方法 使用上面的数据输入USP 公式 (3)和 (4)计算: 检出限 = 0.0033 mg/mL 定量限 = 0.0076 mg/mL II. ICH 方法方法 使用上面的数据输入ICH 公式 (1)和 (2)计算: a. 用用回归线的回归线的y轴截距标准偏差轴截距标准偏差 检出限 = 3.3 x 0.000121/0.3032 = 0.0013 mg/mL 定量限 = 10 x 0.000121/0.3032 = 0.0040 mg/mL * 斜率: 0.3032 *y轴截距标准偏差: 0.000121 b. 用用回归线的残余标准偏差回归线的残余标准偏差 检出限 = 3.3 x 0.000194/0.3032 = 0.0021 mg/mL 定量限 = 10 x 0.000194/0.3032 = 0.0064 mg/mL *斜率: 0.3032 *回归线的残余标准偏差: 0.000194 4 结论结论 : USP方法计算出的检出限和定量限高于ICH方法。

这两种方法是可以接受的 y = 0.3032x + 0.0002 R² = 100.010.020.030.040.050.060.070.0800.050.10.150.20.250.3。