A549细胞培养.doc

A549 细胞的培养A549 细胞为人肺腺癌细胞，属于传代细胞系，可稳定地传代培养一般用胰酶消化后，加入生长液稀释，以 1：2～1：3 传代培养都是可行的一、 [ 所需溶液 ]1，细胞冲洗液：磷酸盐缓冲液(PBS)——无 Ca、MgNACL8.00g；KCL0.20g;240.20g;KHPONa2HPO4. 12HO 1.15g加水至 1 000mL, 将 PH调至 7.4 ，高压灭菌2， 消化液（ 1）胰酶-PBS结晶胰酶 2.5g;高压灭菌后的 PBS1000ml用磁力搅拌器搅拌均匀， 使其完全溶解， 通过 0.22 μm的滤膜过滤除菌，分装备用，放置— 20℃保存 2）胰酶— EDTA:结晶胰酶 0.5g;EDTA盐溶液 0.2g无 Ca、Mg PBS1 000ml用磁力搅拌器搅拌均匀， 使其完全溶解， 通过 0.22 μm的滤膜过滤除菌，分装备用，放置— 20℃保存3， 细胞培养液： RPMI 1640培养液配制方法：（ 1）将一袋干粉型 RPMI 1640 培养基溶于 900ml 三蒸水中，冲洗包装袋两至三次倒入培养液中 2）加入丙酮酸钠 0.1g ，NaHCO22g 以及双抗，加入磁力搅棒并置于磁力搅拌器上充分搅拌。

双抗的配置浓度为 100U/ML 青霉素和 100U/ML 链霉素 ( 一般市售的青霉素为 80 万 U/ 瓶，将其溶解于 4ml 三蒸水中，每升培养液中加入 0.5ml ；市售的链霉素为 100 万 U/ 瓶，将其溶解于 5ml 三蒸水中，每升培养液中加入 0.5ml) 3）调整培养液的ＰＨ值，用ＰＨ精密试纸观察ＰＨ７ . ２～７ . ４即可 4）过滤法除菌，所使用的滤器为Ｏ ２加压过滤，０. ２２μｍ滤膜，滤膜事先采用高压灭菌消毒 5）分装，加盖瓶塞，加封纱布报纸，用绳固定，放置— 20℃保存二、［细胞的维持和培养］１， 细胞的复苏（１） 准备一个盛有３７℃温水的烧杯，从液氮罐中取出存有Ａ５４９细胞的冻存管，放于３７℃温水中，用镊子夹住轻轻摇动使其迅速融化２） 1000～２ 000 r ，3～５ min 离心３） 在无菌操作台中采用 75%的乙醇彻底擦拭冻存管，然后打开冻存管，注意动作要轻柔４） 用 1ml 枪头将上清液去除，加入 1ml 预热的细胞培养液将2细胞吹散开，转移至 25cm培养瓶中５）补充 4ml 的 RPMI 1640培养基，并且添加10%的胎牛血清６）倒置显微镜下观察，37℃、 5%CO2培养。

７）24h 后，更换新的培养液８）常规传代培养２， A549细胞更换新的培养液（１）无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液２）用 PBS反复冲洗细胞2～3 遍３）加入新鲜的预热好的培养液及 10%的胎牛血清各种液体需要量（ ml）表面积25cm275cm22150cm洗涤3510胰酶1～21～32～5培养液51020（４）倒置显微镜下观察，37℃、 5%CO2培养３， A549细胞的传代（１）无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液２）向已经长满的细胞中加入消化液1ml，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有的细胞表面，吸弃或倒掉，轻轻冲洗细胞表面 2～３遍，以尽可能去除原培养液中的牛血清３） 加入 1ml 消化液，在 37℃培养箱中孵育 5～８ min 后把培养瓶放置在倒置显微镜下观察，发现细胞的胞质回缩、胞间质增大后，立即终止消化４） 加入 5ml 预热至 37℃的培养液，用玻璃吸管反复吹打以分散细胞吹打过程按顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有的底部都被吹到2（５） 吸取一半的细胞悬液， 接种到新的 25cm 培养瓶中，补足培养液，并且添加 10%～20%的胎牛血清通常每瓶液体量为 5～10ml。

６） 倒置显微镜下观察， 37℃、 5%CO2培养注意事项 ：（１） 所有液体在加入细胞瓶前均应预热到 37℃所有液体均应调整 PH至 7.2 左右，均不能超过 7.4 ２） 细胞消化传代时吹打不要产生气泡，吹打力量不宜过多，否则会损伤细胞３） 严格执行无菌操作的要求４） 尽可能减少消化液剩余量，过多时会对细胞产生损伤，可多添加些含牛血清的培养液中和５） 培养瓶在室温中放置时间应尽可能短４， A549 细胞的冻存（１） 消化已生长融合的单层细胞２） 用生长液悬浮细胞，并且添加 10%的 FCS和 10%DMSO(二甲基亚砜 ) 分装在 2ml 容积的冻存管中３） 用本实验室自制的冻存包包裹好冻存管， 放在 -70 ℃冰箱中过夜４） 放入液氮中冻存。