浅论人肝细胞生长因子基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究.docx

浅论人肝细胞生长因子基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究【摘要】目的：构建含人肝细胞生长因子(hHGF)基因的骨髓间充质干细胞(MSCs),获得高表达hHGF勺MSCs方法：构建含hHGFg因的腺病毒表达载体PDC316HGFIRESEGFP同源重组法获得含hHGF勺重组腺病毒AdHGF以仅表达gff®因的重组腺病毒AdGFP为对照，体外分别以AdGFP,AdHGF感染MSCs荧光激活细胞分选术检测受染细胞的基因表达效率酶联免疫吸附测定法检测转导细胞培养上清中hHGFg达的浓度和持续时间结果：腺病毒表达载体经限制性内切酶切后有kb的hHGF目的基因片段和kb的线性化载体片段；目的片段测序结果与基因库中hHGFcDN疳列一致病毒液AdHGF纯化后滴度可以达到X1010pfu/mlFACS佥测HGF/MSCS勺GFP阳性率达％HGF/MSC细胞培养上清中hHG南冒持续表达至少14d;最高浓度达到99ng/ml结论：本实验中腺病毒表达载体构建正确；重组腺病毒液AdHGF滴度高；转导后在msc卯获得高效、稳定和持续表达的hHGF该载体达到实验设计要求，为进一步的体内外研究提供了实验依据关键词】间充质干细胞；肝细胞生长因子；腺病毒载体IAbstract]Objective:ToconstructtheadenoviralexpressionvectorsystemcontaininghumanHGFcDNA,andproducetheviruscontaininghHGF,andtofurtherstudythetransducingefficiencyandtheexpressionofHGFinMSCs.Methods:TheHGFcDNAwasamplificatedfromtheexpressionplasmidpCMVHGFbyPCR,andsubclonedintothesamesiteoftheplasmidpDC316IRESEGFPvector.Therecombinants,namedpDC316HGFIRESEGFP,wereidentificatedwithrestrictionenzymedigestionandsequencing.ThenweproducedvirusAdHGFandAdGFPbyhomologousrecombinationinHEK293packagecells,BMMSCsweretransducedWithAdHGF,andHGF/MSCsweregenerated.TheefficiencyofAdHGFtransductionwasassessedbyFACSanalysis.TheHGFconcentrationsinsupernatantsofHGF/MSCsweredeterminedbyELISA.Results:TherecombinantspDC316HGFIRESEGFPcontainedfragmentsofhHGF.TheDNAsequencingofHGFwasidenticaltothereportinGenbank.AfterpackingofthepDC316HGFIRESEGFPinHEK293cells,X1010pfu/mltiterofAdIIGFwasobtained.Fortyeighthoursaftertransduction,%ofHGF/MSCswereGFPpositive,andpeakconcentrationlevelsofhHGFintheculturedsupernatantsweredetected.TheadenovirusmediatedexpressionofHGFbyMSCswasmaintainedforatleast2weeksinvivo.Conclusion:OurdatademonstratedthattheadenoviralexpressionvectorsystempDC316HGFIRESEGFPcontaininghHGFcDNAhadbeenconstructedcorrectly,anditseffectiveexpressionalsohadbeenobtainedinMSCs.Itwillprovidematerialbasisforthenextstudy.IKeywords］mesenchymalstemcells;hepatocytegrowthfactor;adenoviralexpressionvector间充质干细胞在与肝细胞体外共培养时，有促进肝细胞生长的作用；在特定条件下，能分化为肝脏细胞。

将其移植到体内也能促进肝细胞的生长，促进损伤的肝脏尽快恢复［1］同时MSC遑携带外源基因的良好载体肝细胞生长因子是目前公认最强的肝脏再生剂，通过多种途径发挥对肝脏的保护作用：促进肝细胞再生，改善肝功能和减轻肝损害，在临床和实验研究中被广泛应用［2］在体外，HGF^干细胞向肝细胞分化的最关键细胞因子在体内，HGFte促进活化的肝脏干细胞迁移至肝实质，这些干细胞在肝内定植并进一步分化为肝细胞［3］本研究旨在构建高表达人肝细胞生长因子的MSC§为下一步用HGF/MSC始疗肝硬化提供实验依据1材料和方法实验材料质粒与细胞含人全长HGF^因的质粒pCMVHGF由南京医科大学第一附属医院肝脏外科俞悦博士惠赠腺病毒载体穿梭质粒pDC316IRESEGFP、骨架质粒pBHGloxEl3Cre及其包装系统AdMaxTM勾自北京本元正阳基因技术有限公司主要试剂转染用试剂Lipofectamine购自Invitrogen生物技术公司；小鼠抗大鼠CD34单克隆抗体：美国SantaCruzBiotechnology公司；小鼠抗大鼠CD9QCD11b/c,CD29单克隆抗体：美国BioLegend公司；小鼠抗大鼠CD45CD5稗克隆抗体，小鼠IgG1kappa单克隆抗体：美国CatagLaboratories公司；成年Lewis大鼠(雌雄不限，体质量180〜230g),由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

实验方法MSCS勺分离与鉴定:4]无菌条件下分离Lewis大鼠股骨、胫骨，去除软组织，切除股骨两端，用含肝素(20U/ml)的PBS液冲出骨髓，轻轻混匀，使充分散开；利用密度梯度离心法分离MSCs获取单个核细胞，调整细胞浓度为1X105个/ml后，25cm2培养瓶中培养、传代整个实验选用3〜6代细胞，以确保MSCsH勺纯一性和未分化性MSC河表达多种表面抗原MSCs[5],我们选取CD34,CD29,CD45,CD11b/c,CD90,CD54作为其鉴定标记被测细胞浓度用含1%FBS勺PBS缓冲液调节至x106/ml,吸取50pl标本，加入单克隆抗体10pl,室温下与相应单抗避光孵育20minPBS洗2遍后加入mlPBS将细胞打匀，应用FACS佥测BMMSCs表面标志用抗小鼠IgGlFITC,IgGlPE标记的细胞作为阴性对照，每次分析2万个细胞穿梭质粒pDC316HGFIRESEGFP的构建设计带上游AgeI、下游带入NheI的弓物，以pCMVHGF为模板保真扩增HG建因引物序列HGFAgelF：5'TAAACTATACCGGTATGTGGGTGACCAAACTC3’；HGFNheIR：5'TAAACTATGCTAGCCTATGACTGTGGTACCTT3'。

PC砂物用AgeI+NheI双酶切，酶切后回收约2kb的片段，此为片段(1)AgeI+NheI双酶切pDC316IRESEGFP质粒，回收约5kb的大片段，此为片段(2)连接片段(1)、(2)，转化感受态DH&细胞，筛选及小提质粒后，再用AgeI+NheI双酶切，并经测序鉴定，获得重组子PDC316HGFIRESEGFPhg建因腺病毒重组体AdHGF的包装采用细胞内质粒DN桐源重组法：将HEK29望田胞接种于6孔细胞培养板，5X105细胞/孔，培养24h后，取骨架质粒和穿梭质粒pDC316HGFIRESEGFP,用LipofectAMINE脂质体按说明书进行转染获得第1代毒种，作为随后大量病毒扩增的毒种在HG建因的中间部位设计鉴定引物，引物序列为：HGFF：5'GCCAGAGCTCATGTGGGTGAC3’,HGFR5’CTGCGTCGACCTGAGGAATGTC3’扩增长度为600bp取5011l毒种上清液，进行PC嗜定，检测重组腺病毒中是否插入目的基因hHGF重组腺病毒毒种扩增与纯化后，用经典方法测定病毒制品的TCID50值，分装保存于-70C冰箱中AdHGF转染mscs实验分为3组：转染AdHGF的实验组，转染AdGFP空载体的阴性对照组，不加病毒的空白对照组。

转导前24h，收获MSCs细胞，以3X105个/孔的密度接种于6孔板中转导时吸去培养基，加入5ml培养基，CO期孚箱培养6h后补液至10ml72h后,按1：3传代用FAC淞测转染细胞GFPS达，判断HGF^因的转染效率ELISA法检测细胞培养上清hHGFK平MSC^AdHGF,AdGFP转染后，所得细胞分别命名为HGF/MSCsGFP/MSCs收集不同时间点的细胞培养上清，以MSCs*空白对照，检测其中hHG啾度2结果MSCS勺分离、培养和鉴定FACS吉果证实我们分离培养的6代以内细胞均只表达CD29,CD54,CD90而造血干细胞、成纤维细胞、单核细胞及巨噬细胞各自特异性表达的标记CD34,CD45,CD11b/c均呈阴性表达这群细胞特性稳定，扩增一代和两代后的细胞同质性分别达到％,唏口％（图1）穿梭质粒PDC316HGFIRESEGFP的鉴定结果PDC316HGFIRESEGFP经Agel+NheI双酶切，琼脂糖凝胶电泳，可见一大小约kb的DNA^段，与hHGF^因大小一致，表明目的基因已成功克隆至穿梭质粒pDC316HGFIRESEGFP中将鉴定正确的质粒送测序其HGF片段测序结果与基因库NM00101093撅基序列完全吻合。

毒种PCR结果能够特异地扩增出预期大小的条带，证明该重组腺病毒携带目的片段重组腺病毒的构建PDC316HGFIRESEGFP转染HEK293细胞后，几乎所有HEK29做田胞都表达GFP蛋白通过快速CPE确定病毒的感染滴度为X1010效价比为28AdHGF感染msc由勺效率和hgfK平转染效率AdHGF感染msc蜘胞后，知勺msc在田胞都表达GFF^白空白对照组不表达荧光，转染AdGFP空载体的阴性对照组MSCsff4b）和转染AdHgf的MSC的表达荧光细胞培养上清中hgfK平MSCsGFP/MSCS田胞的培养上清中hHGF均不表达，而HGF/MSC细胞培养上清中hHGF呈阳性表达，最高浓度达到99ng/ml,且持续表达时间至少14天3讨论HGFS体内分布广泛，具有多种生物学特性，不仅能刺激肝细胞的再生，促进肝功能恢复，而且可改善肝纤维化，在损伤因子刺激时保护肝细胞［6］HGF＜其受体cmet结合后，调节细胞的增殖、分化、运动和血管生成等［7」HGF勺作用贯穿于整个肝脏的发生、发展及肝再生的过程［8］但外源性HG碰白在体内半衰期短，约15min,所以即使高频率多次重复输注，也不可能维持体内高水平的HGF而且需要的HGF用量以及经济上的花费都是巨大的。

将HGF^因导入合适的细胞，利用细胞自分泌的HGF是针对HGFH白以上不足的有效措施腺病毒载体制备方便，产生的重组病毒滴度高，是常用的载体采用新型AdMax包装体系，可以稳定、快速分泌高滴度的重组病毒，可直接用于感染靶细胞腺病毒转染宿主细胞后，外源基因至少持续表达2周，同时不整合入宿主细胞有文献报道构建了携带hHG理因的。